云南省貢山地區(qū)小型獸類幾種細(xì)菌性病原體攜帶現(xiàn)況調(diào)查*

李伶俐 左曙青 杜春紅 彭紅紅趙秋敏 代 科 張久松**

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)，安徽合肥 230022； 2.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院微生物流行病研究所，病原微生物生物安全國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，媒介生物危害和自然疫源性疾病北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100071； 3.云南省地方病防治所，云南大理 671000)

云南貢山獨(dú)龍族怒族自治縣位于東經(jīng)98°08′～98°56′，北緯27°29′～28°23′之間的滇西北怒江大峽谷北段，東與云南省德欽、維西兩縣相連，西與緬甸毗鄰，南與福貢縣相鄰，北與西藏自治區(qū)察隅縣接壤。高黎貢山地區(qū)物種豐富，素有“世界意義的陸地生物多樣性關(guān)鍵地區(qū)”之稱。小型獸類，特別是嚙齒動物作為自然疫源性疾病最重要的宿主可攜帶和傳播多種與疾病相關(guān)的病原體(Meerburgetal., 2009；Luisetal., 2013；Palmeirimetal., 2014)，如蜱傳腦炎病毒、鼠疫耶爾森氏菌、漢坦病毒、鉤端螺旋體、萊姆病螺旋體、斑點(diǎn)熱立克次體、恙蟲病東方體、埃立克體等，并可使人或動物患病，影響生活質(zhì)量，嚴(yán)重者可致死亡。據(jù)報(bào)道目前全世界鼠類有35個科389個屬，約2 700多種，占世界已知哺乳動物種類數(shù)的42%，大約90%的鼠種能攜帶病原體，有57種與人類疾病相關(guān)(鄭劍寧等，2007)。我國鼠類(嚙齒類)有近200種，已經(jīng)查明可傳播疾病的近80種(琚俊科等，2010)。貢山地區(qū)物種豐富，此前在該地區(qū)對小型獸類的分布進(jìn)行調(diào)查，調(diào)查結(jié)果涉及5目12科42屬76種鼠形小型獸類(高耀亭等，1962；龔正達(dá)等，1989；李璋鴻等，2005)。目前對于云南省自然疫源性疾病的調(diào)查主要集中在西南邊界地區(qū)(吳愛國等，2003；Zhangetal.，2007；張勝勇等，2008；Guoetal.，2013；梁中平等，2014；萬道正等，2017),在西北地區(qū)的相關(guān)報(bào)告較少(劉洪光等，2010；Schmidtetal., 2014)。本研究對貢山地區(qū)小型獸類病原攜帶情況進(jìn)行調(diào)查，為自然疫源性疾病的防制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本采集與鑒定

2014—2015年10和11月在云南貢山地區(qū)設(shè)置采樣點(diǎn)，采用夾夜法和籠捕法誘捕野生小型獸類，即調(diào)查當(dāng)天傍晚時分用鼠夾或鼠籠加食餌隨機(jī)誘捕小獸，次日清晨用特制的布袋收集。將誘捕的小獸在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)用乙醚麻醉或機(jī)械處死，確定其種屬后解剖，取肺、脾標(biāo)本于液氮中進(jìn)行保存。

1.2 主要儀器和試劑

研磨組織所用的儀器為美國Next Advance公司生產(chǎn)的Bullet Blender組織細(xì)胞破碎儀，PCR擴(kuò)增所用儀器為美國Applied Biosystems公司生產(chǎn)的GeneAmp 9700 PCR擴(kuò)增儀，凝膠成像系統(tǒng)來源于法國Viber Loumat公司。DNA聚合酶采用寶生物工程(大連)有限公司生產(chǎn)的Ex-Taq或r-Taq。DNA提取試劑盒采用羅氏High Pure PCR Template Preparation Kit。

1.3 核酸提取與PCR擴(kuò)增

取20 mg左右的小獸組織研磨勻漿后，12 000 r/min離心3 min，離心后得到的沉淀根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行DNA提取，并將得到的DNA置于-40 ℃保存?zhèn)溆谩２捎贸彩絇CR檢測無形體Anaplasmataceae(A.p.)、恙蟲病東方體Orientiatsutsugamushi(O.t.)、斑點(diǎn)熱群立克次體Spotted fever group rickettsiae(SFGR)以及萊姆病螺旋體Lyme disease spirochete等4類病原體。引物根據(jù)基因庫中不同種屬病原體多基因核苷酸序列信息設(shè)計(jì)或者采用已發(fā)表的引物序列，委托北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成，引物序列見表1。反應(yīng)體系為25 μL，其中包括2×Taq Buffer 12.5 μL、10 μmol/L的上下游引物各0.5 μL、模板DNA 4 μL(巢式PCR第2輪模板為0.25 μL第1輪反應(yīng)產(chǎn)物)，加無核酸酶的水補(bǔ)足25 μL。

表1 本研究用于病原體檢測的引物信息Tab.1 Primers used for detection of bacterial pathogens in this study

1.4 核苷酸序列分析

陽性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司進(jìn)行序列測定，將得到的序列信息在GenBank庫中進(jìn)行Blast同源性比對，選擇與該序列同源性相對較高的種屬代表株或血清型代表株以及標(biāo)準(zhǔn)株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生和進(jìn)化分析，利用ClustalX2和Mega 6.0軟件進(jìn)行堿基配對后，用Neighbor-joining方法完成進(jìn)化樹的構(gòu)建并計(jì)算遺傳距離，模型采用Kimura-2-parameter model，Bootstrap值設(shè)定為1 000。

2 結(jié)果

2.1 捕獲小型獸類情況

共捕獲小型獸類759只，涉及14個屬35種。其中構(gòu)成比大于5%的包括姬鼠屬Apodemus221只(29.1 %)、絨鼠屬Eothenomys132只(17.4%)、長尾鼩屬Soriculus105只(13.8%)、白腹鼠屬Niviventer69只(9.1%)、鼩鼱屬Sorex58只(7.6%)、短尾鼩屬Anourosorex58只(7.6%)；構(gòu)成比低于5%的包括鼠兔屬Ochotona27只(3.6%)、家鼠屬Rattus24只(3.2%)以及麝鼩屬Crocidura、田鼠屬M(fèi)icrotus、鼩鼴屬Uropsilus、攀鼠屬Vernaya、針鼴屬Tachyglossus和長吻松鼠屬Dremomys。經(jīng)進(jìn)一步物種鑒定，該地區(qū)野生小型獸類物種構(gòu)成如圖1所示，其中中華姬鼠Apodemusdraco181只，未明確分類的絨鼠Eothenomys80只，分別占23.8%和10.5%。

圖1 捕獲小型獸類的物種構(gòu)成(其他*代表構(gòu)成比低于2%的物種，包括中麝鼩、多齒鼩鼴、四川白腹鼠、高山鼩鼱、滇絨鼠、麝鼩、鼩鼱、褐腹長尾鼩、白腹鼠、大絨鼠、安氏白腹鼠、姬鼠、灰頸鼠兔、滇攀鼠、四川短尾鼩、鼠兔、白腹巨鼠、針尾鼴、大耳姬鼠、小麝鼩、田鼠、珀氏長吻松鼠；絨鼠#是指未明確其物種的絨鼠屬的成員。)Fig.1 Species composition of small mammals captured in this study (Others* represents species with a composition ratio of less than 2%, including C. russula, N. gracills, N. excelsior, S. alpinus, E. eleusis, Crocidura, S. araneus, E. caudatus, R. coxingi, E. miletus, N. andersoni, Apodemus, O. forresti, Red Climbing Mouse, B. quadraticauda, Pikas, R.edwardsi, S. fusicaudus, A. lartronum, C. suaveolens, Microtus, D. pernyi; Eothenomys#represents unclear species in Eothenomys.)

2.2 病原體檢測結(jié)果

分別使用無形體16S rRNA(rrs)基因通用引物、恙蟲病東方體56 kDa基因、斑點(diǎn)熱群立克次體17 kDa基因和檸檬酸合酶(gltA)基因及萊姆病螺旋體5S～23S rRNA間隔區(qū)基因的引物對541只小獸標(biāo)本進(jìn)行PCR擴(kuò)增。當(dāng)采用無形體rrs基因片段引物進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增時，共有17份標(biāo)本出現(xiàn)目的條帶，測序結(jié)果顯示其中12份為新埃立克體CandidatusNeoehrlichiamikurensis、2份為沃爾巴克氏體Wolbachia、3份為巴爾通體Bartonella，陽性率分別為2.2%、3.7‰和5.5‰。12份新埃立克體分別來自7只姬鼠、3只絨鼠、1只鼩鼱和1只白腹鼠；沃爾巴克氏體來源于1只鼩鼱和1只灰腹鼠；3份巴爾通體分別來源于2只絨鼠和1只大足鼠。此外，用該引物擴(kuò)增出的疑似陽性標(biāo)本，在將PCR產(chǎn)物測序后發(fā)現(xiàn)，其中8份均為一種鼠類攜帶的肺炎支原體。采用恙蟲病東方體56-kDa基因P10/P11引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增時，發(fā)現(xiàn)4份標(biāo)本(G243、G575、G728、G735)陽性，陽性率為7.4‰，分別來自白腹鼠、絨鼠、社鼠、社鼠。未發(fā)現(xiàn)斑點(diǎn)熱群立克次體和萊姆病螺旋體陽性標(biāo)本。

2.3 病原體基因特征分析

對部分rrs基因核苷酸序列Blast比對分析顯示，檢測到的12份新埃立克體，分別與分離自我國云南的Yunnan 06-50分離株、分離自日本的FIN686分離株以及分離自波蘭的101 W分離株等的同源性為99.0%(Genbank號為GU227699、AB196304和MG670107)；2份沃爾巴克氏體與wInc_Cu分離株(CP011148)同源性為98.0%；3份巴爾通體分別與分離自歐洲的AR 15-3、Houston-I和1-1C分離株(FN645485、CP020742和CP019489)同源性為99.0%。4份恙蟲病東方體陽性標(biāo)本之間核苷酸序列同源性為74.8%～97.5%。G728和G735核苷酸序列同源性為97.5%，與來自于韓國的Boryong血清型的2014-H30株同源性最高，均為97.0%。G243和來自于臺灣的Kato-related血清型的GU446605同源性最高，為86.0%；G575與來自于韓國的Karp血清型2014-JN08同源性最高，為86.0%。進(jìn)一步采用P34/P55引物對4份標(biāo)本進(jìn)行擴(kuò)增，以獲得更長的基因片段，結(jié)果從G243和G728 標(biāo)本獲得980 bp左右的基因片段。使用Mega 6.0運(yùn)用鄰接法繪制遺傳進(jìn)化樹，如圖2所示，G243和G735位于不同的分支，分別與Kato-related血清型的GU446605和Boryong血清型的L04956遺傳進(jìn)化關(guān)系最近。

圖2 基于Orientia tsutsugamushi 56 kDa基因片段構(gòu)建的進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree based on O. tsutsugamushi 56 kDa gene fragment構(gòu)建進(jìn)化樹所使用的軟件為Mega 6.0，方法為鄰接法，模型為Kimura-2-parameter model，Bootstrap值為1 000，圖中黑色三角符號代表本研究中檢測得到的序列。The NJ tree was constructed by Mega 6.0 program using the method of Kimura2-parameter model, and the bootstrap values was 1 000. The black triangle symbols in this figure represent sequences detected in the present study.

3 討論

無形體科和立克次體科的病原體，如嗜吞噬細(xì)胞無形體、恙蟲病東方體、斑點(diǎn)熱群立克次體，為嚴(yán)格的細(xì)胞內(nèi)寄生菌(Chapmanetal., 2006；Parolaetal., 2013)，可由節(jié)肢動物叮咬脊椎動物后使其獲得感染，并可致人患多種疾病(Chenetal., 1994；Dumleretal., 2005；Walkeretal., 2008)。據(jù)既往調(diào)查報(bào)道，云南省存在人粒細(xì)胞無形體病、恙蟲病、Q熱、流行性斑疹傷寒和斑點(diǎn)熱等立克次體病，且為恙蟲病和斑疹傷寒的高發(fā)區(qū)(Zhangetal., 2007)。

此次調(diào)查發(fā)現(xiàn)，貢山地區(qū)小型獸類中的優(yōu)勢屬為姬鼠屬和絨鼠屬，這與既往在本地調(diào)查結(jié)果一致(龔正達(dá)等，1989)。從捕獲的541只小型獸類中共發(fā)現(xiàn)4種病原體，這些病原體包括新埃立克體、恙蟲病東方體、沃爾巴克氏體和巴爾通體。其中新埃立克體、恙蟲病東方體、巴爾通體等3種病原體可由絨鼠攜帶，提示絨鼠作為當(dāng)?shù)貎?yōu)勢鼠可攜帶多種致病性病原體，對當(dāng)?shù)刈匀灰咴葱约膊〉膫鞑ビ兄匾饬x(Zhangetal., 2014)。

目前，無形體科主要包括無形體屬、埃立克體屬、新立克次體屬、沃爾巴克氏體屬、埃及小體屬以及新埃立克體。本研究采用無形體科rrs基因通用引物進(jìn)行擴(kuò)增檢測，除檢測到12份新埃立克體、2份沃爾巴克氏體陽性外，還檢測到3份巴爾通體。巴爾通體隸屬于巴爾通體科(Bartonellaceae)巴爾通體屬Bartonella，目前為人所熟知的巴爾通體所致疾病有貓抓病(Cat-scratch disease, CSD)、戰(zhàn)壕熱(trench fever)等(Bozhkovetal., 2014)。此次檢測的巴爾通體是對無形體檢測時，意外獲得的結(jié)果，這與此前黎浩等(Lietal., 2012)在對恒河猴進(jìn)行無形體檢測時，意外檢測到巴爾通體的結(jié)果一致。

12份新埃立克體陽性標(biāo)本來源于多個種屬，證實(shí)了該病原體在不同種屬野生小型獸類間分布的廣泛性。Blast比對和遺傳進(jìn)化分析顯示，2份恙蟲病東方體陽性標(biāo)本屬于Boryong血清型；1份與Karp血清型同源性最高，但僅為86.0%；另1份與Kato-related血清型菌株遺傳進(jìn)化關(guān)系最近，但同源性較低(86.0%)，提示這兩份標(biāo)本可能為這兩個血清型的變異株。此次調(diào)查進(jìn)一步證實(shí)云南西北部地區(qū)小型獸類的物種多樣性及其攜帶病原體的多樣性，對相關(guān)自然疫源性疾病防控具有指導(dǎo)意義。