微流控技術在體外細胞轉運系統(tǒng)中應用的研究進展

李　波，王遠萍，段浩博，劉可可，唐思嘉，周　樂，孫宏晨

(吉林大學口腔醫(yī)院實驗教學中心，吉林 長春 130021)

微流控是一種以微組裝結構為基礎并在顯微尺度處理流體的操作技術，其具體操作是處理低體積流體以實現自動化和高通量篩選，通常在亞毫米的規(guī)模對流體實施精確的控制和操縱，流體被移動、混合、分離或以其他方式處理。近年來,微流控技術在醫(yī)學的應用日漸展現其獨特貢獻，電穿孔、熱偏差與流體剪切應力相繼應用于微流控系統(tǒng)設計。微流控技術與傳統(tǒng)膜中斷技術結合為新一代細胞轉運系統(tǒng)的建立提供了新思路。本文作者以細胞的體外轉運系統(tǒng)為例，綜合闡述微流控技術與傳統(tǒng)膜中斷技術結合的具體機制，歸納研究現狀及尚未解決問題，為微流控體外細胞轉運系統(tǒng)提供一個較為全面和詳細的框架。

1　微流控技術

20世紀60年代初集成電路的發(fā)明實現了小型化、微電子的影響潮流，集成電路的微加工技術縮減了流體系統(tǒng)形成第1代系統(tǒng)——氣相色譜法(gas chromatography，GC)[1]。20世紀80年代初形成微流體學，用于噴墨打印頭、DNA芯片、芯片實驗室技術、微推進和微熱技術的開發(fā)。20世紀90年代，微型機械系統(tǒng)開始應用于微流體學[2]。源于半導體工業(yè)的微流控技術，吸納微機電系統(tǒng)(MEMS)自成一體，經常被稱為微型全分析系統(tǒng)(μTAS)或芯片實驗室裝置[3]。微流控是一種以微組裝結構為基礎在顯微尺度處理流體的操作技術[4]。微流控裝置的核心元素為微孔道、室和閥門，用以完成嚴格復雜的操作[4]，其原理包括微量流體層流、低擴散率、流體表面效應以及電動力學[1]。由于樣品處理快、用量小、流體分析時控制精確，大幅度減少了樣品和試劑的損耗量，微流控技術迅速取代了傳統(tǒng)的實驗操作[3]，成為備受矚目的新技術。微流控應用于化學、工程、生物和藥品等眾多領域。微流控在生物醫(yī)學的應用主要包括以下幾個方面[4]：分子水平的核酸、蛋白質分析；細胞水平研究細胞力學、細胞遷移、細胞分離、細胞分類還有單個細胞分析；材料轉運；仿生設計的材料轉運和藥物投遞芯片。

2　體外細胞轉運系統(tǒng)

2.1傳統(tǒng)的膜中斷技術除了載體介導的核酸轉染轉運系統(tǒng)[5]，基于膜中斷技術的體外轉運系統(tǒng)也備受關注[6]。膜中斷技術主要應用物理方法例如機械、電擊、熱力、光學和化學因素使細胞膜形成暫時的斷裂[6]，使轉運物質直接穿透細胞膜進入細胞。以下為幾種傳統(tǒng)的膜中斷方法：化學方法包括膜活性肽、洗滌劑和穿孔毒素[7]；機械中斷方法如高速粒子穿透作用、流體剪切應力作用[8]和靜水壓/滲透壓的壓力作用[9]；顯微注射法[10]；熱偏差法[6]；電穿孔等。傳統(tǒng)的膜中斷技術有3個明顯不足[6]：①傳統(tǒng)的膜中斷技術會造成細胞膜不同程度的損傷，損傷程度小阻礙納米顆粒的有效投遞，損傷程度大導致細胞損傷；②吞吐量和可伸縮性(如顯微注射)差；③細胞恢復不充分，導致細胞死亡。例如熱擊和電擊將導致蛋白質失活和細胞損傷。而近年來，通過微流控操作劑微流控平板或微流控芯片實現的膜中斷技術有效地彌補了傳統(tǒng)膜中斷技術的不足。細胞的材料轉運尤其強調基于膜中斷技術的投遞方法以及納米技術、微流控和實驗室芯片技術在該領域的應用。

2.2新一代體外轉運系統(tǒng)新一代轉運系統(tǒng)的建立對基于細胞治療和基因編輯的再生醫(yī)學和基礎生物學十分必要[6]，臨床試驗中基于體外細胞治療的有效案例主要包括造血干細胞[11]和T細胞的免疫治療[12]。基因編輯可應用于抗腫瘤免疫治療[13]。向多種細胞轉運多種不同材料是新一代轉運系統(tǒng)面臨的主要挑戰(zhàn)[6]。相對于傳統(tǒng)轉運系統(tǒng)，新一代轉運系統(tǒng)主要有4個特點：①改進了傳統(tǒng)轉運系統(tǒng)，細胞損傷小；②極大地提高了轉運效率和吞吐量；③為細胞靶向物質轉運提供了新思路；④安全性高，體外物質轉運對臨床應用具有借鑒意義。

3　微流控在基于膜中斷技術的體外轉運系統(tǒng)中的應用

3.1 微流控與電穿孔結合與傳統(tǒng)的整體電穿孔不同，通過微流控裝置實現的電穿孔技術根據細胞的規(guī)模定位電擊領域，進而降低電壓(傳統(tǒng)方法所需為100 V)、提高熱量耗散速率[14]，降低對細胞的損傷并且極大地提高了轉運效率[15]。恒定直流電壓可以造成水流中細胞電穿孔，Geng等[16]進行如下設計使恒定電壓的強度和頻率根據細胞流動時收縮程度變化，主通道設置一部分收縮部，脈沖強度由主通道和收縮部之間的橫截面比決定，而頻率有細胞流過的速度決定。根據不同類型細胞的直徑確定收縮部的管道直徑和水流速度，選擇適合的電壓強度和頻率。Garcia等[17]設計了一個微流控系統(tǒng)提高了細菌細胞電轉運的效率和吞吐量，微流控裝置非均一收縮的微管道使相對較小的電壓形成了一個高電流區(qū)域。流體動力學的介入，比之傳統(tǒng)電穿孔方法，轉運效率提高了4倍，吞吐量提高了100～1 000倍。對比于傳統(tǒng)的操作技術，微流控技術的應用為新一代細胞投遞系統(tǒng)提供了新思路。

3.2微流控與熱偏差法結合傳統(tǒng)的熱偏差法雖然能夠實現細胞內的材料投遞，但會嚴重損傷細胞功能。微流控裝置為局域或部分實行熱中斷技術提供了可能。實際上，熱噴墨打印機處理的細胞溶液證明了基因轉染的成功，但不清楚細胞的膜中斷實現是源自噴嘴處的流體剪切效應，還是溫度尖峰或兩者均有[18]。由高聚焦超聲熱觸發(fā)的藥物釋放已經成為一種重要的藥物投遞方法，這種方法根據脂質對溫度敏感的特點，能夠將能量聚焦于一定區(qū)域從而減少對細胞的損傷。當攜帶藥物的脂質體隨血液循環(huán)到達患處，高聚焦超聲熱觸發(fā)使患處細胞通透性增加，實現靶向給藥[19]。Meng等[19]建立了一個微流控模型探討其機制，微流控裝置由40對環(huán)形電極組成，鑲嵌在1 mm厚、128°Y旋轉和X傳播的LiNbO3基板上，并由單相位單向換能器操控。微流控裝置中央放置一個材料為聚二甲基硅氧烷(PDMS)的微型細胞培養(yǎng)皿保證溫度不變，小鼠乳腺癌細胞通過聚-L-賴氨酸黏附在PDMS表面，加入封裝多柔吡星的脂質體。該實驗檢測細胞溫度、應力變化并闡明其作用機制，結果顯示：低熔點的脂質在熱能作用下通透性發(fā)生變化，聲波輻射力使細胞膜損傷。雖然已有以上研究，但熱偏差法的作用機制仍未完全解決。

3.3 微流控與納米芽膜結合納米芽管作為生物分子向細胞內轉運的通道確保持續(xù)的物質釋放[20]，Xu等[21]利用納米芽管轉運系統(tǒng)將功能性探針轉運到細胞膜內，Xu等[22]將納米芽膜與微流控結合建立了一個有趣的細胞轉運系統(tǒng)。在納米芽膜表面形成密度為3 × 107cm-2、直徑為100 nm的顯微孔道，猶如在納米膜表面建立極密的顯微注射針。將納米芽膜襯于微流控平板培養(yǎng)室底，培養(yǎng)室通過納米芽膜與其下100 μm深、0.5 mm寬的流體通道相同，當溶有轉運物質的流體快速流經顯微孔道時，便可通過納米芽膜的針刺作用完成細胞的物質轉運。

3.4微流控與機械力結合機械擾動的膜中斷技術主要包括黏附細胞的刮擦和珠粒負載[23]或由小規(guī)格針頭重復抽吸排出的懸浮液中的細胞[24]?，F代微流控技術可以增加機械力的精確度，例如細胞擠壓的原理是細胞在通過細胞直徑的約一半至三分之一的微流體收縮時快速變形，蛋白質、核酸、量子點、碳納米管和其他納米材料已被證明可以通過這種方式遞送[25]。Saung等[26]設計了一個微流控裝置，在微流控平板的孔道上設置一個收縮部，根據不同類型的細胞直徑確定收縮部的孔道直徑和孔道長度，細胞通過收縮部時出現暫時的破壞，載體即可進入細胞。

椎板黏度計表面由固體變成液體時可以產生一個確定的剪切應力，能夠使單層細胞頂層細胞膜瞬時透化[27]。根據這一現象設計了微流控裝置，微流控的微孔道為由直徑300 μm漸變?yōu)?0 μm的錐形孔道，可以根據細胞流速產生相應的剪切應力[28]。但是剪切應力不易重復控制，需輔以微米尺寸的空化氣泡[29]，19世紀80年代引入了一種新的滲透化方法[30]，即聲波作用可以在溶液中產生空化氣泡[31]。然而，最近多個公開的數據集分析表明超聲主要對遞送具有大于50%效率或50%活性的體外分子具有較好的成果[31]。這歸因于隨機和劇烈空化的操作機制是異質的，一些細胞經歷過度損傷，而其他細胞則不受影響[32-33]?？栈瘹馀莸木_定位為靶向空化提供了良好開端。

4　結　語

目前，世界各地研究機構和臨床中心使用的細胞內材料遞送方法主要為基于病毒載體、脂質體載體和電穿孔等實驗方法，這些已建立的方法具有機制復雜、安全性小及其對細胞行為不可預測的影響等缺點，明顯地限制了生物實驗的范圍并降低了潛在有希望的細胞治療概念的功效。因此，安全有效的細胞投遞系統(tǒng)的建立對細胞實驗十分重要，并且對細胞治療和基因治療等臨床應用具有推動作用[6]。近年來，微流控技術在細胞水平和分子水平的應用具有巨大進展。微流控為細胞內的材料以及生物大分子的遞送提供了良好平臺，尤其是與基于膜中斷技術的傳統(tǒng)遞送方法結合，建立了系統(tǒng)的微流控模型。而且微流控技術為細胞的靶向遞送提供了新思路，對于不同類型的細胞已有相應類型的遞送材料或生物分子，微流控裝置和微流控技術未來極有可能實現向不同系別的細胞投遞不同分子的商業(yè)化產品。微流控是建立新一代投遞技術的重要方法，微流控技術與醫(yī)學研究的結合及微流控裝置在醫(yī)學的應用值得不斷地探索研究。

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