鱘魚腸道微生物多樣性的研究

李小義， 張效平， 趙 鳳， 孔 杰， 趙 飛， 周 洲， 王艷艷

(貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水產(chǎn)研究所，貴州貴陽 550025)

腸道微生物是人體及動(dòng)物腸道的正常組成部分，對宿主的營養(yǎng)和健康有重要影響。研究表明，腸道微生物可參與宿主的營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收、能量代謝、過敏、自身免疫疾病等多方面調(diào)節(jié)過程[1-3]，對宿主的年齡亦有指示作用[4]。近年來，腸道微生物與水產(chǎn)動(dòng)物的聯(lián)系受到了越來越多的關(guān)注。Kan等將金魚暴露在0～100 μg/L的五氯苯酚中，對金魚腸道微生物變化進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，擬桿菌屬豐度與五氯苯酚濃度呈正相關(guān)，擬桿菌門、擬桿菌屬及厚壁菌門/擬桿菌門之比對金魚在五氯苯酚環(huán)境中的體質(zhì)量和肝質(zhì)量均有重要影響[5]。Rolig等對斑馬魚腸神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)行缺失突變處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腸道發(fā)炎個(gè)體中促炎性細(xì)菌菌群較多，而在同樣做缺失突變的腸道正常個(gè)體中具有抗炎作用的細(xì)菌菌群較多，研究表明腸道微生物對斑馬魚腸道健康具有重要作用[6]。此外，動(dòng)物體腸道始終處于動(dòng)態(tài)變化，攝食方式和腸道微生物種類、數(shù)量及占例均有影響，動(dòng)物體內(nèi)腸道菌群結(jié)構(gòu)合理有助于加快宿主的生長和改善肉質(zhì)[7]。唐楊等在凡納濱對蝦飼料中添加蠟樣芽孢桿菌，試驗(yàn)組凡納濱對蝦生長速度比空白組平均快15.2%，且試驗(yàn)組中菌群豐度變化明顯，相對不添加蠟樣芽孢桿菌的對照組，試驗(yàn)組中變形菌門豐度有所下降，而擬桿菌門豐度有所增加[8]。

鱘魚為高蛋白、多脂肪性魚類，是世界上優(yōu)良的淡水魚品種，也是現(xiàn)存于世界上最珍奇古老的冷水性生物魚群之一，有“活化石”之稱，其肉厚骨軟，同時(shí)鱘魚卵可以加工成鱘魚子醬，具有“黑色黃金”之稱。魚體含有人體必需的多種氨基酸，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和藥用價(jià)值。本研究對10月齡鱘魚苗腸道微生物多樣性進(jìn)行了初步分析，獲得對鱘魚健康有利的微生物菌群信息，對益生菌在鱘魚類飼料添加劑中的應(yīng)用及減少抗生素使用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

2016年5月，從貴州省水產(chǎn)研究所惠水試驗(yàn)基地采集10月齡鱘魚苗數(shù)條、養(yǎng)殖水體3 L(標(biāo)記為S)及飼料20 g(標(biāo)記為SL)。迅速帶回實(shí)驗(yàn)室，不投餌暫養(yǎng)3 d。

1.2 試劑與儀器

DNA Marker、細(xì)菌DNA提取純化等試劑，購自上海生工生物工程股份有限；Gel-Doc2000凝膠成像分析儀，購自 BIO-RAD公司；電泳儀，購自北京市六一儀器廠。

1.3 鱘魚腸道采集

待鱘魚腸糞便排空后，在超凈臺中對鱘魚進(jìn)行解剖取樣。用75%乙醇對鱘魚體表消毒后用解剖剪沿肛門朝前對鱘魚進(jìn)行解剖。清理出腸道，75%乙醇擦拭消化道外壁，無菌PBS緩沖液沖洗，5 mL滅菌離心管分別收集前、中、后腸并作標(biāo)記，Q4、Q5為前腸樣品，Z4、Z5為中腸樣品，H4、H5為后腸樣品。

1.4 腸道微生物DNA提取

對解剖取得的鱘魚腸道樣品，使用天根試劑盒提取DNA，具體方法見試劑盒說明書。用1.5%瓊脂糖凝膠對提取獲得的DNA樣品質(zhì)量進(jìn)行檢測，并將合格樣品干冰保存寄送北京諾禾致源生物信息科技有限公司進(jìn)行測序分析。

1.5 16S rDNA文庫構(gòu)建及多樣性分析

利用16S V4區(qū)引物(515F：5′-GTGCCAGCMGCCGCGG TAA-3′和806R：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)對腸道微生物DNA進(jìn)行擴(kuò)增。采用Illumina Hiseq平臺對擴(kuò)增獲得的測序結(jié)果進(jìn)行分析。截去Barcode和引物序列后使用FLASH對每個(gè)樣品的reads進(jìn)行拼接，后去除嵌合體序列，得到最終有效數(shù)據(jù)。利用Uparse軟件(Uparse v7.0.1001)對所有樣品全部有效數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類，默認(rèn)以97%的一致性將序列聚類成為OTU。對OTUs代表序列進(jìn)行物種注釋，用Mothur方法與SILVA的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物種注釋分析(設(shè)定閾值為0.8～1.0)，獲得分類學(xué)信息并分別在各分類水平：kingdom(界)、phylum(門)、class(綱)、order(目)、family(科)、genus(屬)、species(種)統(tǒng)計(jì)各樣本的群落組成。使用PyNAST軟件(Version 1.2)與GreenGene數(shù)據(jù)庫中的“Core Set”數(shù)據(jù)信息進(jìn)行快速多序列比對，得到所有OTUs代表序列的系統(tǒng)關(guān)系。最后以樣品數(shù)據(jù)量最少的為標(biāo)準(zhǔn)對各樣品數(shù)據(jù)進(jìn)行均一化處理。使用Qiime軟件(Version 1.7.0)計(jì)算Observed-species、Shannon指數(shù)、Goods-coverage、Unifrac距離及構(gòu)建UPGMA樣品聚類樹，使用R軟件(Version 2.15.3)繪制稀釋曲線，Rank abundance曲線，物種累積曲線，進(jìn)行Alpha多樣性指數(shù)組間差異分析并繪制PCA、PCoA、NMDS圖。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌16S rRNA基因測序結(jié)果分析

以序列相似性97%一致性(identity)的原則將序列聚類成為1個(gè)OTU(operational taxonomic unit)。鱘魚腸道微生物樣品共獲得8 239個(gè)OUT，其中Q4、Q5樣品分別含有 1 432、1 771個(gè)OUTs，Z4、Z5樣品分別含有1 702、1 064個(gè)OUTs，H4、H5樣品分別包含165、847個(gè)OUTs(表1)。從養(yǎng)殖水體S樣品和飼料SL樣品中分別獲得861、602個(gè)OUTs。覆蓋率(good’s coverage)是測序獲得的序列占整個(gè)基因組的比例，用以評估抽樣完整性。本研究中所有樣品的覆蓋率為97.7%～99.7%，表明本次檢測結(jié)果具有較好的覆蓋性。通過單樣本的多樣性分析(Alpha多樣性)可以反映樣品內(nèi)的微生物群落的豐富度和多樣性，Shannon是用來估算樣品中微生物多樣性指數(shù)之一，其值越大表明群落多樣性越高，本研究中鱘魚腸道前腸樣品Shannon指數(shù)最高，表明鱘魚前腸細(xì)菌多樣性豐富，后腸樣品Shannon指數(shù)最低，為0.365。結(jié)果表明，養(yǎng)殖水體中細(xì)菌多樣性較飼料高，而鱘魚腸道細(xì)菌微生物多樣性表現(xiàn)為：前腸>中腸>后腸(表1)。稀釋曲線是從樣品中隨機(jī)抽取一定測序量的數(shù)據(jù)，統(tǒng)計(jì)它們所代表物種數(shù)目(即OTUs數(shù)目)，以抽取的測序數(shù)據(jù)量與對應(yīng)的物種數(shù)來構(gòu)建曲線。稀釋曲線可直接反映測序數(shù)據(jù)量的合理性，并間接反映樣品中物種的豐富程度，本研究各樣品稀釋曲線較為平緩(圖1)，說明測序數(shù)據(jù)量逐漸趨于合理。

表1 基于16S rRNA基因序列的細(xì)菌多樣性指數(shù)

2.2 細(xì)菌多樣性分析

根據(jù)物種注釋結(jié)果在門水平對物種相對豐度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，由圖2可知，其中相對豐度排前10的物種包括變形菌門(Proteobacteria)、藍(lán)細(xì)菌門(Cyanobacteria)、梭桿菌門(Fusobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、綠彎菌門(Chloroflexi)、酸桿菌門(Acidobacteria)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)及硝化螺旋菌門(Nitrospirae)。前腸樣品組G6中變形菌門相對豐度最高，為 75.0%，其次為擬桿菌門(12.9%)、厚壁菌門(5.2%)、放線菌門(2.3%)、酸桿菌門(1.3%)。中腸樣品組G7中亦包含較多的變形菌門(57.4%)，其次為擬桿菌門(18.6%)、厚壁菌門(10.2%)、放線菌門(4.3%)、酸桿菌門(3.5%)。后腸樣品組G8中，除了變形菌門(66.0%)豐度較高以外，梭桿菌門(30.7%)明顯高于前腸組(0.71%)和中腸組(0.77%)。水體樣品G4(S)中，豐度較高的物種包括變形菌門(50.8%)、放線菌門(26.2%)、梭桿菌門(11.7%)、擬桿菌門(7.7%)、厚壁菌門(1.8%)。飼料樣品G5(SL)中豐度較高的物種包括藍(lán)細(xì)菌門(59.5%)、變形菌門(29.8%)、厚壁菌門(8.1%)、擬桿菌門(1.1%)。前中后腸、水樣及飼料樣品中變形菌門均為主要優(yōu)勢物種。前中腸細(xì)菌在門水平物種類型及豐度差異不大，后腸細(xì)菌和前中腸內(nèi)細(xì)菌差異明顯。

在菌屬水平上對每個(gè)樣品的菌群結(jié)構(gòu)及分布進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，由圖3可知，5個(gè)樣品組豐度前10的菌屬包括：假單胞菌屬(Pseudomonas)、氣單胞菌屬(Aeromonas)、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、unidentified Marinilabiaceae、Sedimenticola、地桿菌屬(Geobacter)、Polynucleobacter、unidentified Chloroplast及unidentified Mitochondria。前腸樣品組G6中，假單胞菌屬豐度最高，為23.18%，其次為氣單胞菌屬(7.23%)、不動(dòng)桿菌屬(3.73%)、黃桿菌屬(2.47%)、unidentified Marinilabiaceae(2.43%)、Sedimenticola(2.20%)。中腸樣品組G7中，豐度排名前6的菌屬分別為unidentified Marinilabiaceae(4.22%)、Sedimenticola(3.13%)、地桿菌屬(2.60%)、假單胞菌屬(2.37%)、不動(dòng)桿菌屬(1.74%)、氣單胞菌屬(1.40%)。后腸樣品組G8中，主要包括氣單胞菌屬(0.52%)、假單胞菌屬(0.47%)、不動(dòng)桿菌屬(0.13%)、Sedimenticola(0.07%)、unidentified Marinilabiaceae(0.06%)、unidentified Chloroplast(0.03%)。養(yǎng)殖水體樣品組G4中，Polynucleobacter豐度最高為4.06%，其次為黃桿菌屬(1.27%)、unidentified Chloroplast(0.70%)、假單胞菌屬(0.51%)、unidentified Marinilabiaceae(0.43%)、氣單胞菌屬(0.29%)。飼料樣品組G5中，unidentified Chloroplast豐度最高(59.50%)，其次為unidentified Mitochondria(21.33%)、假單胞菌屬(1.35%)、氣單胞菌屬(0.77%)、unidentified Marinilabiaceae(0.27%)、不動(dòng)桿菌屬(0.21%)。不同來源樣品組中細(xì)菌豐度各不相同，后腸樣品組G8細(xì)菌多樣性與其他組相差較大，不含unidentified Mitochondria、Polynucleobacter及Geobacter等3個(gè)屬的細(xì)菌。

2.3 核心微生物菌落分析

繪制成韋恩圖對不同樣品(組)之間共有、特有的OUT進(jìn)行分析，由圖4可知，其中前腸2個(gè)克隆共有OUTs 980個(gè)，前腸2個(gè)克隆樣本及養(yǎng)殖水體和飼料樣品共有OUTs 307個(gè)，優(yōu)勢菌屬包括Marinifilum(2.61%)、假單胞菌屬(2.28%)、黃桿菌屬(1.63%)。中腸2個(gè)克隆樣本共有OUTs 852個(gè)，中腸2個(gè)克隆樣本及養(yǎng)殖水體和飼料樣品共有OUTs315個(gè)，主要包括Marinifilum(2.54%)、假單胞菌屬(2.22%)、黃桿菌屬(1.59%)、芽孢桿菌屬(1.27%)、unidentified_Marinilabiaceae(1.27%)及Bacteroides(1.27%)等菌屬。后腸2個(gè)克隆樣本共有OUTs 79個(gè)，后腸樣品及養(yǎng)殖水體和飼料共有OUTs 26個(gè)，在門水平上主要為變形菌門(73.08%)和厚壁菌門(15.38%)。

3 討論

近年來，研究者對人體[9-10]、斑馬魚[11]、虹鱒魚[12]、果蠅[13]及蝴蝶[14]等脊椎和非脊椎動(dòng)物腸道微生物多樣性均進(jìn)行了研究。Ni等對24條草魚腸道微生物多樣性進(jìn)行了研究，共發(fā)現(xiàn)1 228種細(xì)菌(116種古細(xì)菌和1 112種細(xì)菌)，其中大部分屬于厚壁菌門、變形桿菌門及梭桿菌門，此外筆者還發(fā)現(xiàn)，以黑麥草為飼料喂養(yǎng)的草魚腸道微生物在草魚腸道碳代謝、氨基酸代謝及脂肪酸代謝過程中作用顯著[15]。Tzeng等研究發(fā)現(xiàn)，變形桿菌門是日本沼蝦腸道微生物豐度最高的細(xì)菌門類，其次為厚壁菌門和放線菌門[16]。李建柱等研究發(fā)現(xiàn)魚菜共生模式下的草魚、鯽、鰱及鳙4種鯉科魚類腸道微生物優(yōu)勢菌均為鯨桿菌屬、梭狀芽孢桿菌屬、擬桿菌屬及芽孢桿菌屬，表明魚類腸道微生物組成不完全由食性決定[17]。蘭阿峰等研究發(fā)現(xiàn)大鯢腸道微生物以變形菌門為主，其次還包含梭菌門、芽孢桿菌門及衣原體門[18]。

目前，對鱘魚腸道微生物的研究較少。Ghorbani等對閃光鱘胃腸道可培養(yǎng)細(xì)菌進(jìn)行了分離鑒定， 其中分離獲得的細(xì)菌以腸桿菌科中的氣單胞菌、假單胞菌及沙門氏菌為主[19]。Zahra等人從西伯利亞鱘腸道中分離純化獲得129株單菌，并利用5種致病菌對這129株單菌的益生效果進(jìn)行了研究，其中乳酸球菌屬(7株)、芽孢桿菌屬(2株)及檸檬酸桿菌屬(1株)對致病菌的抵抗作用效果明顯[20]。

采用高通量測序分析方法，本研究對鱘魚腸道微生物多樣性進(jìn)行了分析。門水平分析，前中腸樣品組主要包括變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)及放線菌門(Actinobacteria)，該結(jié)果與王純等研究的草魚腸道微生物組成相似[21]。后腸樣品組中，主要以變形菌門(Proteobacteria)和梭桿菌門(Fusobacteria)為主。有研究表明，宿主健康狀況及發(fā)育階段的不同均會對腸道微生物組成產(chǎn)生影響[22-23]。本研究中，前中后腸微生物差異原因可能與食物在前中后腸中處于不同狀態(tài)有關(guān)，具體原因有待進(jìn)一步研究。