內(nèi)生菌發(fā)酵工藝的研究進展*

★ 史毅 陳文彬 張博文 鄭紅梅 柴華文 葉耀輝*（江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 南昌 330004）

植物中所包含的豐富的次生代謝物，是天然藥物開發(fā)的寶庫，從植物中篩選藥用活性物質(zhì)已成為炙手可熱的研究方向。植物內(nèi)生菌具有種類多、分布廣、生物學(xué)功能多樣等諸多優(yōu)點，并在寄生于宿主植物的過程中，自主產(chǎn)生一系列具有殺蟲、抗菌、抗氧化、抗病毒、抗腫瘤及免疫抑制等藥用作用的活性物質(zhì)。因此，從植物內(nèi)生菌中尋找并開發(fā)新的生物活性物質(zhì)已成為當今生物學(xué)研究的熱點。近年來，借助于生物發(fā)酵相關(guān)工程技術(shù)具有發(fā)酵周期縮短、能耗減小、生產(chǎn)成本降低、菌體生長加快、副產(chǎn)物減少、產(chǎn)物產(chǎn)率提高且發(fā)酵工藝簡單，過程易實現(xiàn)自動化控制等諸多優(yōu)點，進一步地開發(fā)了植物內(nèi)生菌發(fā)酵工藝的應(yīng)用前景。由于每種內(nèi)生菌具有各自不同的菌種的特性，因而需要提供不同的發(fā)酵條件才可以幫助其生成發(fā)酵產(chǎn)物。故而當前研究者在研究內(nèi)生菌的發(fā)酵工藝時，主要圍繞發(fā)酵工藝優(yōu)化展開，包括培養(yǎng)基的不同營養(yǎng)成分（碳源、氮源、微量元素等）以及發(fā)酵條件（溫度、pH值、溶氧量等）。

1 內(nèi)生真菌發(fā)酵種類的研究

內(nèi)生真菌的發(fā)酵方法研究主要包括液體深層發(fā)酵和固體發(fā)酵，前者占用空間小、周期短、產(chǎn)物生成量大、可分離純菌絲體、成本低等；后者則設(shè)備簡單、發(fā)酵條件易控制、培養(yǎng)物中各成分均可得到充分利用等。兩種發(fā)酵方法各自具有不同的優(yōu)點，可根據(jù)其發(fā)酵目的選擇性使用。液體發(fā)酵主要用于內(nèi)生真菌的活性產(chǎn)物或提取物的相關(guān)研究中，如曾茜等［1］借助于液體發(fā)酵的方式來對蒿屬植物中的內(nèi)生真菌Penicillium sp.具有抗癌活性的產(chǎn)物進行了相關(guān)研究；都曉偉等［2］采用了內(nèi)生菌液體發(fā)酵的方式來提高穿山龍?zhí)崛∥镏惺硎氃碥赵暮浚欢腆w發(fā)酵則主要側(cè)重于研究培養(yǎng)基配方的優(yōu)化及產(chǎn)物的分離鑒定情況，如李信軍等［3］對兩株內(nèi)生真菌菌株的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基配方進行了優(yōu)化；張瑤［4］采用固態(tài)發(fā)酵的方式研究了白木香內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物的分離鑒定情況。

目前隨著將中藥運用于藥用或食用真菌的發(fā)酵基質(zhì)，一種新型的固體發(fā)酵方法也油然而生［5］。當具有活性成分的藥性基質(zhì)被藥用真菌發(fā)酵時，不僅可以提供真菌生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)，促進其大量生長，還能夠因為真菌的酶而改變其原有的組織成分，因此該種發(fā)酵方式具有雙向性。如當藥用人參在靈芝中發(fā)酵時，隨著一系列復(fù)雜的生理活動及生化反應(yīng)，將會產(chǎn)生新成分與新功能［6］。莊毅等［7］就借助了雙向性發(fā)酵工程發(fā)現(xiàn)了新藥槐芪菌質(zhì)。并發(fā)現(xiàn)槐耳菌和黃芪組合發(fā)酵后所生產(chǎn)的槐芪菌質(zhì)所提成分具有保肝、促進機體免疫功能及抗病毒等藥理作用。

2 培養(yǎng)基對發(fā)酵的影響

內(nèi)生菌發(fā)酵的培養(yǎng)基主要被用于為內(nèi)生菌生長或者代謝提供所需的能量及營養(yǎng)物質(zhì)，其成分的組成不僅會對菌體的生長和繁殖能力及發(fā)酵物的生成效率造成直接性的影響，而且還會對發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)量及質(zhì)量造成嚴重的影響［8］。通常情況下，培養(yǎng)基的成分會根據(jù)菌體的品種、發(fā)酵條件的差異及發(fā)酵階段的不同而進行選擇。在培養(yǎng)基中直接影響其質(zhì)量的四大營養(yǎng)要素分別為碳源、氮源、無機鹽以及生長因子［9］。

2.1 培養(yǎng)基中碳源成分對發(fā)酵的影響培養(yǎng)基中的碳源成分是被用來為微生物提供能量、輔助細胞結(jié)構(gòu)及產(chǎn)物的生成。碳源主要是由單糖、雙糖、多糖、油脂、天然復(fù)合物等成分所構(gòu)成，淀粉、葡萄糖、蔗糖等是最為常用的碳源。適宜的碳源種類和濃度將會直接對菌體生長和芽孢生成造成影響［10］。李莎莎等［11］在對芽孢桿菌的生長研究中發(fā)現(xiàn)該菌對有機碳源玉米漿的利用效果最好，培養(yǎng)24h后菌量可達到3.58×108CFU/mL。劉超等［12］在對菌種不同碳源的利用情況的研究中發(fā)現(xiàn)，菌株XP-8無法利用單糖中的蘋果酸；而對各個碳源的利用能力分別為麥芽糖＞葡萄糖＞木糖＞可溶性淀粉。白建軍等［13］研究發(fā)現(xiàn)，沙棘根瘤內(nèi)生菌對碳源要求比較嚴格，多數(shù)只能利用丙酸或葡萄糖、吐溫等。李倩瑋等［14］選用7種類型的培養(yǎng)基對花生種子中內(nèi)生細菌進行分離，結(jié)果表明，選擇牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基分離得到的內(nèi)生細菌最多，有57株，而以乙烯（ACC）為唯一碳源的內(nèi)生細菌最少，為23株。

2.2 培養(yǎng)基中氮源成分對發(fā)酵的影響氮源是微生物蛋白質(zhì)和其他含氮有機物的來源。氮源主要分為有機氮源和無機氮源，包括蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸、硫酸銨、硝酸銨、等。由于銨鹽中的氮與細胞中的氮處于相同的氧化水平，故比較之下無機氮更容易被菌體快速吸收利用［15］，雖然有機氮延長了菌體的吸收利用時間，但有機氮可以顯著地促進菌體增殖和芽孢的生成?？傮w來說，菌體酶系在生長初期沒有構(gòu)建完整時，無機氮源會幫助菌體對營養(yǎng)成分的吸收利用；然而在后期酶系完善構(gòu)建后，則菌體會分解并利用富含更多營養(yǎng)物質(zhì)的有機氮源。

除了碳源、氮源的構(gòu)成種類對菌體產(chǎn)生影響外，適宜的碳氮比也會對其產(chǎn)生一定的影響，不當?shù)奶嫉葧咕w按照一定的比例對營養(yǎng)物質(zhì)進行吸收，將會抑制菌體的正常生長和產(chǎn)物的合成效率。因此有效地調(diào)控培養(yǎng)基成分中的碳氮比，可以幫助菌體的生長，提升產(chǎn)物的生成效率。Idris等［16］研究發(fā)現(xiàn)，以ACC為唯一氮源的內(nèi)生菌的比例（36%）較根際微生物的比例（20%）高。郭偉等［17］研究發(fā)現(xiàn)不同氮源培養(yǎng)基中，蛋白胨作為氮源時菌落生長最快，培養(yǎng)20d后菌絲體增至6.47mm。王曉洋等［18］在不同氮源對菌株溶磷效果比較實驗研究中，得出四株內(nèi)生細菌在以以硫酸銨為氮源的培養(yǎng)基中溶磷效果最佳，W3溶磷能力最強，且改變無機磷基礎(chǔ)培養(yǎng)基中碳氮比對菌株W3的溶磷效果有影響。

2.3 培養(yǎng)基中無機鹽成分對發(fā)酵的影響培養(yǎng)基中的無機鹽成分會直接影響微生物的正常生長及產(chǎn)物的生成。研究表明，當金屬離子的濃度過低時，會促進菌體的生理活動，當濃度過高時則會阻礙微生物的正常代謝及繁殖。比如無機鹽中的磷元素，參與了微生物的生理代謝活動并構(gòu)成了細胞中核酸等輔酶的生成。江明明等［19］把所得的內(nèi)生菌菌懸液接種于NBRIP無機磷固體培養(yǎng)基中，在28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～5d，通過有無解磷圈的生成及生成解磷圈的大小來評價內(nèi)生菌的解磷能力。無機鹽中的鈣離子不僅可以調(diào)節(jié)細胞的生理狀態(tài)，而且可以提高發(fā)酵的含菌量，促進菌體發(fā)酵時的效率。除上述提及到的無機鹽外，鋅、鎂、鈷、鉬、錳以及鐵等元素都是微生物賴以生長的微量元素，均在一定程度中影響發(fā)酵產(chǎn)物的生長情況。林星辰等［20］在優(yōu)化人參內(nèi)生菌B69抑菌活性產(chǎn)物的發(fā)酵條件中，從11種不同的無機鹽組合中篩選了最適合其生長的無機鹽條件為0.5%的NaCl。宋歌等［21］在將無機鹽培養(yǎng)基中添加污染物作為唯一碳源篩選時發(fā)現(xiàn)，菌株CPY-4和菌株SGL-1可以在只提供4-BDE的無機鹽培養(yǎng)基中存活，菌株CPY-4，SGL-1、菌株4、菌株13可以在提供BDE209和aroclor1254的無機鹽培養(yǎng)基中存活。

3 培養(yǎng)條件對發(fā)酵的影響

除了培養(yǎng)基對發(fā)酵具有重要的影響外，發(fā)酵條件在對于菌體的生長中也發(fā)揮了重要作用，適宜的培養(yǎng)條件，不僅有助于菌體的生長繁殖，而且可以提高微生物對底物的利用能力，使代謝朝向有益于發(fā)酵產(chǎn)物的生成進行。因而通過調(diào)控發(fā)酵條件（溶氧量、溫度、pH值等），能夠為菌體的生長創(chuàng)造適宜的環(huán)境，從而提升微生物的繁殖能力、獲得質(zhì)量更高的發(fā)酵產(chǎn)物。

3.1 溫度對發(fā)酵的影響溫度作為影響內(nèi)生菌代謝生長過程中至關(guān)重要的影響因素，在發(fā)酵培養(yǎng)過程中將會對內(nèi)生菌細胞質(zhì)膜的流動性、物質(zhì)的溶解及酶活性產(chǎn)生重要的影響。當培養(yǎng)的溫度過高時，會一定程度內(nèi)破壞適合菌體生長的平衡環(huán)境，進而阻礙菌體的正常生長，此外溫度過高也會導(dǎo)致菌體中的蛋白質(zhì)成分發(fā)生凝固及變性，甚至造成菌體死亡；當溫度過低時，也會嚴重影響菌體的正常生長，因此在發(fā)酵培養(yǎng)菌體的過程中需要為菌體的生長創(chuàng)造合適的溫度環(huán)境［22］。

溫度除了受菌體種類的影響外，還會由于產(chǎn)物的不同而所需的溫度不同。在優(yōu)化發(fā)酵溫度的階段中還需要綜合參考其他的發(fā)酵條件及因素，例如能源消耗、發(fā)酵周期、產(chǎn)率水平和培養(yǎng)基成分等，必要時還可以考慮變溫培養(yǎng)。王壯等［23］在篩選五味子葉枯病菌拮抗放線菌A-25-8的發(fā)酵溫度條件時，選擇了溫度為25℃、28℃、31℃和34℃等4個梯度，最終得出28℃為該菌的溫度最佳條件。李艷賓等［24］以產(chǎn)黃酮甘草內(nèi)生真菌YF-A為研究對象，在研究發(fā)酵溫度對其發(fā)酵影響時，發(fā)現(xiàn)該內(nèi)生真菌的最佳發(fā)酵溫度為32℃。李娟等［25］發(fā)現(xiàn)菌株X對病原菌的抑制率隨溫度的變化基本上呈倒鐘型，從24℃到28℃，隨著溫度的升高，其體內(nèi)生化反應(yīng)速率上升，其抑制率也逐漸上升，由28.34%升高到46.57%。

3.2 pH值對發(fā)酵的影響pH值是確保菌體正常繁殖、代謝的重要參數(shù)，選擇合適的pH值將會對不同種類的菌體生長及發(fā)酵產(chǎn)物的合成造成重要的影響。其主要原因在于：（1）pH值可以通過影響菌體內(nèi)各種酶的活性，來進一步地對菌體的生長繁殖和新陳代謝造成影響；（2）pH值能夠通過影響培養(yǎng)基中某些重要的營養(yǎng)物質(zhì)的利用率及中間代謝產(chǎn)物的解離來間接地影響內(nèi)生菌對于營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和利用［26］；（3）pH值可以改變原生質(zhì)膜的電荷，從而使細胞膜的透性、膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和物質(zhì)的溶解性均受到了一定的影響，最終影響了菌體對于營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，抑制了菌體的生長速率［27］；張濤等［28］人在探究煙草黑脛病拮抗菌的抑菌實驗中發(fā)現(xiàn)，在pH3～6（酸性條件）時抑制效果較差，7～9（中性或弱堿條件）時抑制效果較好，其中以pH7.6（自然）對煙草黑脛病的抑制作用最好。李欣等［29］研究拐棗七的莖部內(nèi)生細菌GZJR-8時發(fā)現(xiàn)，該菌發(fā)酵最適pH為7.5～8。

3.3 溶氧對發(fā)酵的影響在好氧真菌的發(fā)酵過程中，通常會通過控制溶氧量來達到調(diào)控發(fā)酵的目的。溶氧不僅能夠為菌體的正常生長及代謝提供所需的氧氣，而且它還會對菌體次生代謝產(chǎn)物的合成途徑及合成速率造成嚴重的影響。若供氧不足，則會造成內(nèi)生菌無法正常的吸收代謝營養(yǎng)物質(zhì)，甚至?xí)绊懓l(fā)酵液中的酸堿度，進而促進了有毒物質(zhì)的生成，此外，供氧不足還會抑制發(fā)酵產(chǎn)物形成前的前體物質(zhì)的積累，從而阻礙了菌體的生長及代謝產(chǎn)物的合成。菌體發(fā)酵過程中的供氧一般是通過調(diào)節(jié)通氣量、攪拌速度、轉(zhuǎn)速、裝液量等來實現(xiàn)的。

周寧等［30］在對甘蔗葉產(chǎn)黃酮內(nèi)生真菌的研究中，通過轉(zhuǎn)速來調(diào)節(jié)發(fā)酵過程中的溶氧量。當搖床轉(zhuǎn)速由100r/min升至125r/min時菌絲體生物量明顯增加，當轉(zhuǎn)速達到125r/min時有最大生物量積累，超過125r/min時生物量緩慢下降。當轉(zhuǎn)速緩慢時，培養(yǎng)基內(nèi)的溶解氧也會隨之減少，這不僅會影響菌絲的生長，同時也會導(dǎo)致代謝產(chǎn)物產(chǎn)量降低；當轉(zhuǎn)速增加時，培養(yǎng)基發(fā)酵液中的溶氧量也顯著增加，但倘若轉(zhuǎn)速過快時，由于強烈的機械刺激，會促使細菌發(fā)生機械性的損傷，會嚴重抑制菌絲和產(chǎn)物的產(chǎn)量。葉云峰等［31］人研究發(fā)現(xiàn)在眾多影響枯草芽抱桿菌B47產(chǎn)抗菌物質(zhì)的因素中裝液量的影響力是最強的，隨著裝液量的減少菌體生成產(chǎn)物的能力逐漸增強，由此可見裝液量（溶氧）對菌體產(chǎn)物的生成是成正相關(guān)的。一般情況下，發(fā)酵培養(yǎng)液中裝液量越少，溶氧量就越大。較少的裝液量有益于提高溶氧，但是太少也會因為營養(yǎng)物質(zhì)的缺乏而阻礙菌體的正常生長；較多的裝液量能夠為菌體的繁殖供應(yīng)足夠的營養(yǎng)，但另一方面會導(dǎo)致溶氧能力下降，不足以維持菌體增殖所需要的氧分［32］。

雖然目前在國內(nèi)外已經(jīng)有很多的研究者研究了溶氧條件的優(yōu)化，但關(guān)于內(nèi)生菌發(fā)酵系統(tǒng)中氧傳遞的相關(guān)研究甚少，尤其是對如何在使用生物反應(yīng)器來進行大規(guī)模發(fā)酵時借助通氣和攪拌來增加發(fā)酵液中的溶氧還鮮見研究，因此未來關(guān)于對氧傳遞方面的研究將會為后續(xù)指導(dǎo)反應(yīng)器放大工作產(chǎn)生重要的影響。

3.4 發(fā)酵時間對發(fā)酵的影響發(fā)酵過程中選擇合適的培養(yǎng)時間不僅節(jié)省了整個發(fā)酵工藝時間，而且還降低了發(fā)酵成本。柏鈺等［33］選用了8個發(fā)酵時間點來測定發(fā)酵罐和搖瓶培養(yǎng)發(fā)酵液的抗菌作用，結(jié)果顯示當罐發(fā)酵3d時每100mL發(fā)酵液中菌體生物量達到最高（1.65±0.052）g，4d時抗菌活性最高為（33.56±1.34）%；而搖瓶發(fā)酵在5d時每100mL發(fā)酵液中菌體生物量達到最高（0.82±0.035）g，7d時抗菌活性最高為（53.20±0.76）%。由此找出了最適宜的發(fā)酵條件，為發(fā)酵優(yōu)化奠定了基礎(chǔ)。發(fā)酵的培養(yǎng)時間優(yōu)化通常都是通過設(shè)定不同發(fā)酵時間梯度來確定最適宜發(fā)酵時間的，如史云峰等［34］在研究優(yōu)化皺邊石杉高產(chǎn)HupA功能內(nèi)生菌發(fā)酵培養(yǎng)基最佳時間時，分別在4個不同的時間點設(shè)置了兩個平行樣，恒溫振蕩培養(yǎng)測定HupA的產(chǎn)量。

在調(diào)控發(fā)酵培養(yǎng)條件時，除了能夠?qū)囟?、pH、溶氧、發(fā)酵時間進行改變外，還可以通過改變接種齡來實現(xiàn)。接種齡是指從菌絲接種于種子罐到將其轉(zhuǎn)移到下一級種子罐或發(fā)酵罐間的時間。若接種時種齡偏小，則會導(dǎo)致發(fā)酵前期菌體生長變緩、發(fā)酵周期被延長、發(fā)酵產(chǎn)物生成時間被拖延，甚至?xí)甬惓０l(fā)酵的情況發(fā)生。若接種時種齡偏大，亦會加快菌體消耗培養(yǎng)基的速度，誘發(fā)菌體快速生長，進而使得菌體過早自溶，因此，選擇適當?shù)姆N齡是非常重要的［35］。

4 優(yōu)化內(nèi)生菌發(fā)酵工藝的方法

在研究內(nèi)生菌發(fā)酵工藝的優(yōu)化問題時，通常會結(jié)合統(tǒng)計學(xué)的方法來調(diào)控各個影響內(nèi)生菌發(fā)酵產(chǎn)物的因素，使發(fā)酵效率得以提升，最終系統(tǒng)、高效、低成本的獲得內(nèi)生菌發(fā)酵產(chǎn)物。就目前來看，在優(yōu)化發(fā)酵工藝時普遍應(yīng)用正交實驗設(shè)計法，但隨著統(tǒng)計方法的發(fā)展，出現(xiàn)了Plackett-Burman試驗設(shè)計方案篩選并結(jié)合響應(yīng)面設(shè)計法，兩者共同應(yīng)用優(yōu)化發(fā)酵工藝。

4.1 正交試驗設(shè)計法正交實驗設(shè)計法是采用正交表對多因素進行分析的一種數(shù)理統(tǒng)計方法，在一個實驗中設(shè)定多個因素和變量，通過對比分析找出符合實驗條件的最佳他因素組合。采用正交試驗設(shè)計法可以很好地判斷影響微生物發(fā)酵的主要因素。該法具有方法簡單、效率高以及工作量小等特點，進而廣泛應(yīng)用于內(nèi)生菌發(fā)酵工藝的優(yōu)化。馬冠華等［36］通過正交實驗設(shè)計法對煙草內(nèi)生細菌Itb57的發(fā)酵條件進行優(yōu)化，對5個實驗因素進行4因素正交實驗設(shè)計，共進行16個因素組合實驗，確定了煙草內(nèi)生細菌Itb57的最佳發(fā)酵條件：初始pH值7，培養(yǎng)時間72h，恒溫28℃，搖瓶轉(zhuǎn)速180r/min，裝液量25mL/500mL每瓶。

4.2 響應(yīng)面設(shè)計法響應(yīng)面設(shè)計法（Response Surface Methodology，RSM）是將試驗設(shè)計、統(tǒng)計分析、數(shù)學(xué)建模等方法結(jié)合來對相關(guān)數(shù)據(jù)進行分析，并利用多元二次回歸方程在因素和響應(yīng)值之間建立函數(shù)關(guān)系的擬合，從而優(yōu)化工藝參數(shù)。響應(yīng)面設(shè)計法是解決多變量因素的最為簡單有效的試驗方法其中最為常用的方法是Box-Behnken設(shè)計（Box-Behnken Design，BBD）和中心組合設(shè)計（Central Composite Design，CCD）［37］。目前研究中，響應(yīng)面設(shè)計法通常會結(jié)合Plackett-Burman試驗來篩選影響發(fā)酵結(jié)果的重要因素，實現(xiàn)高效提升發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)量的目的。孫力軍等［38］在研究金銀花內(nèi)生菌EJH-1時，采取了Plackett-Burman和響應(yīng)面等設(shè)計法優(yōu)化了金銀花內(nèi)生菌EJH-1產(chǎn)生抗菌作用的培養(yǎng)基。何璐等［39］利用Plackett-Burman分析法設(shè)計試驗，選擇影響的主效應(yīng)因子，用統(tǒng)計學(xué)的原理、對試驗數(shù)據(jù)進行極差分析，最后利用RSM分析法，得到了苦參內(nèi)生真菌BS001菌株的最佳發(fā)酵條件。

5 內(nèi)生菌發(fā)酵工藝目前的缺點及今后的研究進展

科學(xué)技術(shù)與生物技術(shù)水平的快速發(fā)展使得內(nèi)生真菌發(fā)酵技術(shù)在醫(yī)藥行業(yè)、農(nóng)業(yè)、工業(yè)、食品業(yè)中得到了普及應(yīng)用，相信在未來能夠利用內(nèi)生菌發(fā)酵技術(shù)來解決更多的生產(chǎn)難題。不斷運用內(nèi)生真菌發(fā)酵技術(shù)，探索、優(yōu)化、改進發(fā)酵工藝能夠大幅的提升工作效率，并促使發(fā)酵工程技術(shù)往更為廣泛的領(lǐng)域發(fā)揮應(yīng)用價值［40］。近年來，內(nèi)生真菌的發(fā)酵生產(chǎn)越來越顯示出了巨大的發(fā)展前景，而且發(fā)酵工藝也到了有效的改進，基于高產(chǎn)菌種選育、發(fā)酵條件優(yōu)化等方法的改善使得內(nèi)生真菌產(chǎn)活性物質(zhì)的能力獲得了顛覆性的提高。然而，目前的研究項目大都停留在實驗室階段，很難使大規(guī)模的發(fā)酵生產(chǎn)在中、大型企業(yè)中的到工業(yè)化的發(fā)展［41］。探其因由在于缺乏適于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)的高產(chǎn)菌株，

以及發(fā)酵策略未能系統(tǒng)的調(diào)控。因此，尋找高產(chǎn)內(nèi)生菌株和建立系統(tǒng)性的內(nèi)生真菌發(fā)酵工藝控制流程，將成為今后最重要的研究方向。