菟絲子提取物對(duì)失眠大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及神經(jīng)遞質(zhì)的影響*

★ 劉海云 宋渺渺 肖愛嬌*（江西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 南昌 330004）

失眠是一類以經(jīng)常不能正常睡眠為特征的疾病，臨床常見病癥是入睡困難、睡眠質(zhì)量下降和睡眠時(shí)間減少，記憶力、注意力下降等［1］。隨著生活節(jié)奏的加快和工作壓力的增加，失眠人群呈逐年增多的趨勢(shì)。根據(jù)最新睡眠調(diào)查研究結(jié)果顯示中國(guó)成年人失眠率為39.3%［2］。失眠降低了患者的生活質(zhì)量，嚴(yán)重影響了自身及家人的身心健康。對(duì)于失眠臨床上常用的藥物副作用比較大，有成癮性和依賴性。因此尋找一種有效而副作用小的藥物預(yù)防和治療失眠是當(dāng)務(wù)之急。中藥菟絲子是一年生攀緣性的草本寄生性種子植物，是一種常用補(bǔ)陽(yáng)藥物，性平、味辛甘，歸腎、肝、脾經(jīng)，具有補(bǔ)腎益精、養(yǎng)肝明目、固精縮尿、安胎止瀉的功效［3］。本實(shí)驗(yàn)室對(duì)菟絲子的研究較多，本團(tuán)隊(duì)關(guān)于菟絲子方面的國(guó)家級(jí)省廳級(jí)課題有10余項(xiàng)，論文幾十篇都主要局限于性腺生殖內(nèi)分泌方面的研究，但在失眠方面的研究還未涉及。此次實(shí)驗(yàn)利用PCPA致大鼠失眠作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，通過(guò)觀察中藥菟絲子對(duì)失眠大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響并測(cè)定中藥菟絲子對(duì)大鼠神經(jīng)遞質(zhì)5-羥色胺（5-HT）及多巴胺（DA）含量的影響并初步探討其治療失眠的作用及其機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物SPF級(jí)SD大鼠50只，體重（200±20）g，大鼠由江西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，雌雄各半，許可證號(hào)SYXK（贛）2016-0026。室溫20℃～22℃，空氣新鮮，通風(fēng)良好，大鼠雌雄分籠固體飼料喂養(yǎng)，自由飲水，正式開始實(shí)驗(yàn)前適當(dāng)飼養(yǎng)7天左右。

1.2 試劑五羥色胺（5-HT）、多巴胺（DA）、對(duì)氯苯丙氨酸（PCPA）試劑盒均購(gòu)于Sigma有限公司。安定（地西泮）注射液購(gòu)于江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院門診部，中藥菟絲子購(gòu)于南昌益豐大藥房。

1.3 儀器微量進(jìn)樣器（德國(guó)eppendorf公司）；恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司）；AdventurerTM電子天平（奧豪斯國(guó)際貿(mào)易有限公司）；TGL-16G型臺(tái)式高速離心機(jī)（上海市實(shí)驗(yàn)儀器總廠）；TECAN酶標(biāo)儀sunrise（奧地利TECAN公司）。

2 方法

2.1 菟絲子提取物的制備［4］稱取菟絲子中藥250g，加入2000mL水浸泡120min，至菟絲子藥材微脹，微火煎煮2次，每次煎煮時(shí)間30min，過(guò)濾2次提取液合并一起，至水浴鍋中濃縮至生藥濃度為0.4g/mL，放于美的冰箱冷藏，備用。

2.2 動(dòng)物分組與給藥SPF級(jí)SD大鼠50只，雌雄各半，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組（安定組注射液0.92mg/kg）、菟絲子給藥組（菟絲子100、300mg/（kg·d）劑量組），各組10只。除空白對(duì)照組外，其他各組均采用腹腔注射PCPA混懸液（350mg/kg）建立大鼠失眠模型，每天1次，連續(xù)2天［5］。從造模第3天開始陽(yáng)性對(duì)照組給于灌胃安定注射液（0.92mg/kg）（安定注射液的給藥量是根據(jù)成人的臨床用量，按大鼠的等效劑量折算系數(shù)得來(lái)的），菟絲子給藥組同時(shí)給予灌胃不同濃度的菟絲子低、高劑量提取物，正常對(duì)照組和失眠模型組給于相同體積的生理鹽水灌胃，每天灌胃給藥1次，持續(xù)7天。，

2.3 學(xué)習(xí)記憶能力測(cè)試Y迷宮行為學(xué)的觀察 參 照 文 獻(xiàn)［6］。 在 MG-2型 Y 迷 宮（ 規(guī) 格100mm×150mm×250mm）內(nèi)，分安全區(qū)（A）、電擊區(qū)（B）和起步區(qū)（C）。在實(shí)驗(yàn)測(cè)試時(shí)接通電流給予小鼠電刺激，小鼠從C區(qū)接受電擊刺激后，能1次性從C區(qū)直接跳到A區(qū)為正確反應(yīng)，否則屬錯(cuò)誤反應(yīng)。通過(guò)觀察它能否有效避開并正確找到安全區(qū)來(lái)判斷小鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力。實(shí)驗(yàn)小鼠最后一次給藥60min后，開始進(jìn)行學(xué)習(xí)記憶能力訓(xùn)練，首先把小鼠放入Y迷宮并讓其適應(yīng)6～8min，再進(jìn)一步把實(shí)驗(yàn)小鼠放進(jìn)起步區(qū)，接通電流，記錄小鼠接受電擊后的反應(yīng)，并記錄其結(jié)果。注意兩次電擊訓(xùn)練之間讓小鼠休息1min。如果連續(xù)訓(xùn)練10次都對(duì)或者9次正確即為小鼠已經(jīng)學(xué)會(huì)空間辨認(rèn)。達(dá)標(biāo)時(shí)所需的訓(xùn)練次數(shù)作為學(xué)習(xí)成績(jī)。一天后用相同的訓(xùn)練方法再進(jìn)行訓(xùn)練，訓(xùn)練時(shí)的錯(cuò)誤次數(shù)記為記憶成績(jī)。

2.4 血清的制備最后一次給藥12h后腹主動(dòng)脈取血，放于離心機(jī)（3000r/min）離心10min，微量加樣器吸取上清液備用。-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.5 血清中5-HT和DA的測(cè)定按試劑盒里的詳細(xì)說(shuō)明步驟進(jìn)行操作，測(cè)定5-HT和DA的含量。

2.6 統(tǒng)計(jì)處理各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS 17.0進(jìn)行處理，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以 表示，通過(guò)LSD法分析并進(jìn)行組間兩兩比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 一般情況造模前飼養(yǎng)期間，大鼠活動(dòng)正常，警惕性高，進(jìn)水進(jìn)食正常，晝夜活動(dòng)規(guī)律，毛發(fā)有光澤，給于腹腔注射PCPA后，大鼠出現(xiàn)明顯的失眠癥狀，晝夜節(jié)律紊亂，白天活動(dòng)增強(qiáng)，興奮性和攻擊性都明顯增加，飲食減少，體重減輕，毛發(fā)變得無(wú)光澤，表明造模成功。給于安定和菟絲子治療后，失眠的癥狀有所改善，晝夜規(guī)律逐漸恢復(fù)正常但給藥組稍低于安定組，但比模型組好轉(zhuǎn)很多。

3.2 菟絲子對(duì)失眠大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響失眠模型組與正常對(duì)照組相比，學(xué)習(xí)達(dá)標(biāo)次數(shù)和記憶錯(cuò)誤次數(shù)均增多，表明學(xué)習(xí)記憶能力下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；菟絲子給藥組與失眠模型組相比，大鼠學(xué)習(xí)和記憶錯(cuò)誤次數(shù)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。見表 1。

表1 菟絲子提取物對(duì)失眠大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響（ ，n=10） 次

3.3 菟絲子對(duì)失眠大鼠血清5-HT和DA含量的影響與正常對(duì)照組比較，失眠模型組大鼠血清5-HT含量顯著降低，DA含量顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.05）。與模型組比較，菟絲子低、高劑量給藥組和安定組大鼠血清5-HT含量均顯著升高，DA含量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.05）。見表 2。

表2 菟絲子提取物對(duì)失眠大鼠血清5-HT和DA含量的影響（ ，n=10） ng/mL

4 討論

對(duì)氯苯丙氨酸（PCPA）是5-HT合成的抑制劑，通過(guò)抑制色氨酸輕化酶降低5-HT的含量但同時(shí)又不會(huì)損傷神經(jīng)元，此種造模方法經(jīng)濟(jì)有效，造模時(shí)間短，成功率很高，是目前國(guó)內(nèi)外常用的大鼠失眠模型的造模方法［5，7-9］。大鼠腹腔注射PCPA后，可選擇性地阻斷腦5-HT的合成，使腦5-HT含量下降，睡眠減少，甚至消失。關(guān)于睡眠的機(jī)制目前不是很明確，一些研究表明，睡眠是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)的過(guò)程，其發(fā)生與中樞的一些結(jié)構(gòu)和神經(jīng)遞質(zhì)如5-HT、DA、NE等有關(guān)［10］。5-HT和DA是調(diào)節(jié)睡眠和覺醒的主要物質(zhì)，5-羥色胺的神經(jīng)元主要分布于中縫核群，在覺醒時(shí)5-HT神經(jīng)元分泌大量的5-HT作用于中樞的特定部位，促進(jìn)促眠因子的釋放啟動(dòng)睡眠［11］。大鼠通過(guò)腹腔注射對(duì)氯苯丙氨酸（PCPA），阻斷了體內(nèi)5-HT的合成，降低了血清5-HT的含量，從而造成睡眠啟動(dòng)障礙，睡眠減少甚至消失。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，與正常對(duì)照組相比，失眠模型組大鼠血清中5-HT含量顯著降低；與失眠模型組相比，菟絲子低、高劑量組大鼠血清中5-HT含量明顯升高。說(shuō)明菟絲子取物對(duì)失眠大鼠體內(nèi)5-HT有明顯的增強(qiáng)效果，從而進(jìn)一步起到治療失眠的作用。

DA是覺醒狀態(tài)下的重要的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)，通過(guò)體內(nèi)DA能神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮作用，如果體內(nèi)DA神經(jīng)元興奮，體內(nèi)DA含量升高就會(huì)造成睡眠減少，覺醒增加。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，與正常對(duì)照組相比，失眠模型組大鼠血清中DA含量顯著增加；與失眠模型組相比，菟絲子低、高劑量組大鼠血清中DA含量明顯降低。說(shuō)明菟絲子提取物有降低失眠大鼠體內(nèi)DA的含量，從而進(jìn)一步起到治療失眠的作用。

總之，實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明失眠模型組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力和5-HT含量下降，DA含量顯著升高，而菟絲子提取物干預(yù)后能明顯改善失眠大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，顯著升高血清中5-HT含量，降低其DA含量，證明菟絲子提取物在治療失眠方面有一定作用，為進(jìn)一步研究菟絲子的臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。