腺苷A2A受體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷中的相關(guān)研究進展

，，，

[1. 陸軍軍醫(yī)大學(第三軍醫(yī)大學)野戰(zhàn)外科研究所分子生物學中心創(chuàng)傷燒傷及復合傷國家重點實驗室，重慶 400038；2.陸軍軍醫(yī)大學(第三軍醫(yī)大學)研究生院，重慶 400038]

中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)損傷包括創(chuàng)傷性損傷和非創(chuàng)傷性損傷，非創(chuàng)傷性損傷含義較廣。本文專指血管性損傷，包括出血、缺血等。CNS損傷以其高發(fā)生率和高死殘率，已經(jīng)成為緊迫的世界性公眾健康問題[1]。雖然在這一領域已經(jīng)有大量的研究，但直至目前，尚缺乏安全有效的治療方法。因此，探索CNS損傷的治療方法、靶點是神經(jīng)科學領域亟待解決的關(guān)鍵問題。腺苷(adenosine)在人體的各個系統(tǒng)廣泛分布，包括心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等，其通過4種腺苷受體(adenosine receptor,AR)亞型，即A1R、A2AR、A2BR和A3R發(fā)揮多種不同效應。在CNS損傷后，細胞外腺苷濃度會大幅度升高，引起腺苷受體的活化[2]，以激活A1R及A2AR為主，A2AR雖然表達不如A1R豐富，但在許多病理條件下卻發(fā)揮更為主導的作用[3]。本文就現(xiàn)有研究現(xiàn)狀，針對A2AR在中樞神經(jīng)損傷中的作用與機制進行綜述，以期為A2AR的臨床應用提供理論支撐。

1 中樞神經(jīng)系統(tǒng)的腺苷及A2A受體

1.1 中樞神經(jīng)系統(tǒng)腺苷及腺苷的生化代謝

腺苷是一種內(nèi)源性的嘌呤核苷，是嘌呤核苷酸的前體物質(zhì)與代謝產(chǎn)物，在生理和病理情況下都發(fā)揮重要的作用。腺苷一方面來源于膠質(zhì)細胞或神經(jīng)末梢釋放[4-5]，另一方面來自三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)的代謝。無論細胞內(nèi)或細胞外的ATP都可以經(jīng)過二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)、一磷酸腺苷(adenosine monophosphate,AMP)，并通過5’-核苷酸酶催化形成腺苷[6]。

而對于腺苷的代謝，腺苷經(jīng)腺苷激酶催化形成AMP，AMP再轉(zhuǎn)變?yōu)锳DP。ADP可經(jīng)腺苷酸環(huán)化酶生成環(huán)1-磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)，cAMP再經(jīng)磷酸二酯酶催化形成AMP。 與此同時，腺苷還可以經(jīng)腺苷脫氨酶形成肌苷，再經(jīng)核苷酶形成次黃嘌呤。另外，在細胞內(nèi)腺苷可以與S-腺苷基高半胱氨酸 (SAH) 相互轉(zhuǎn)化。使用核素示蹤技術(shù)可以發(fā)現(xiàn)，50%的腺苷被細胞攝取，25%降解為肌苷。

生理情況下組織中的腺苷濃度低于1～2 μmol/L，然而在CNS損傷后，腺苷的細胞外濃度急劇升高(100～1 000 μmol/L)[7]，有多種原因可以導致細胞外腺苷的急劇上升。在損傷早期，細胞外腺苷升高的主要原因是由于大量釋放到細胞外ATP迅速代謝成腺苷。隨后的病理過程中，腺苷主要通過平衡核苷轉(zhuǎn)運體2(equilibrative nucleoside transporter 2，ENT 2)從細胞內(nèi)釋放[8]；與此同時損傷導致的富集核酸轉(zhuǎn)運體2和3(concentrative nucleoside transporters (CNT) 2 and 3)以及平衡核苷轉(zhuǎn)運體1(ENT1)的下調(diào)使細胞外核苷的細胞再攝取受到抑制，從而加重了細胞外核苷濃度的上升[9]。

1.2 中樞神經(jīng)系統(tǒng)腺苷A2AR與其活化后的信號通路

腺苷受體可以分為四種亞型，并且已經(jīng)被分子克隆，分別是A1R、A2AR、A2BR和A3R。不同的腺苷受體，介導不同的效應。高親和力的A1R，A2AR，腺苷濃度較低時就可產(chǎn)生作用。而 A2BR 和 A3R 的親和力較低，一般僅在病理情況下有大量腺苷時才可活化。

A2AR蛋白由410個氨基酸構(gòu)成，其氨基酸序列在哺乳動物中具有高度同源性。在CNS中，A2AR的腦區(qū)分布主要在紋狀體、伏隔核、嗅球，同時在海馬、皮質(zhì)、杏仁核及下丘腦等區(qū)域也有少量分布；A2AR在多巴胺能神經(jīng)元、小膠質(zhì)細胞以及星形膠質(zhì)細胞均有表達，在炎性細胞(包括淋巴細胞和顆粒細胞等)也有表達。A2AR在突觸前和突觸后都有表達：突觸前主要表達于谷氨酸能、GABA能、膽堿能以及去甲腎上腺素能投射纖維；突觸后主要存在于GABA能神經(jīng)元，并且在這類神經(jīng)元上有較多的多巴胺D2受體。

A2AR是興奮性受體，與Gs蛋白偶聯(lián)，是環(huán)磷腺苷(cAMP)-蛋白激酶A(PKA)通路的關(guān)鍵步驟[10]，同時也有文獻報道也與Golf 偶聯(lián)[11]。與其他腺苷受體類似，A2AR與MAPKs通路偶聯(lián)[12]，而也有文獻報道在海馬突觸小體發(fā)現(xiàn)了A2AR可直接激活蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)[13]。此外 ，A2AR還可以與其他受體及信號分子相互作用：例如，能與A1受體、多巴胺D2受體、代謝型谷氨酸受體5亞型(metabotropic glamate 5 receptor，mGlu 5)、N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid，NMDA)受體及大麻素1受體結(jié)合形成異源二聚體或相互作用[14]。另外有文獻報道，A2AR能結(jié)合成纖維細胞生長因子和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)，從而影響突觸傳遞[15]。

2 中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷中A2AR的作用與機制

目前的研究表明，A2AR阻斷劑與激動劑對CNS損傷的效應隨病程發(fā)展變化。CNS損傷后，細胞外谷氨酸濃度急劇上升，并且這種上升時間在缺血性腦損傷中至少維持4 h，在顱腦創(chuàng)傷中至少維持12 h。細胞外大量谷氨酸引起的興奮性毒性作用引起了急性組織損傷與炎癥級聯(lián)反應，并且已經(jīng)證明A2AR受體激活在加劇細胞外谷氨酸濃度上升中起關(guān)鍵作用。在隨后的幾小時至數(shù)天的病理過程中，炎癥反應由炎癥細胞級聯(lián)放大，而在免疫細胞上的A2AR受體激活卻可以降低免疫細胞在腦實質(zhì)中的激活、黏附、與血管壁滲透能力[16]。因此，A2AR拮抗劑對早期興奮性毒性作用起保護作用，而A2AR激動劑在隨后的病理過程中穩(wěn)定炎癥細胞，減輕炎癥反應起保護作用。

2.1 A2AR拮抗劑對早期繼發(fā)性損傷的作用與機制

2.1.1 A2AR拮抗劑可以降低損傷后細胞外谷氨酸濃度以及NMDA受體功能

A2AR受體拮抗劑的保護效應主要依賴于對興奮性毒性反應的控制，全身系統(tǒng)性或局部使用選擇性A2AR拮抗劑ZM241385對紅藻氨酸鹽(kainate)以及聯(lián)合使用喹啉酸(quinolinic acid)與白介素(IL-1)[17]引起的興奮性毒性作用都有保護作用。

在紋狀體，A2AR主要表達在伽馬氨基丁酸-腦啡肽(γ-aminobutyric acid(GABA)-enkephalin)能神經(jīng)元上，突觸前則在谷氨酸能突觸末梢上豐富表達[18]，因此A2AR可以直接參與調(diào)控谷氨酸的釋放[19]。在海馬，A2AR也對神經(jīng)遞質(zhì)的釋放起關(guān)鍵調(diào)控作用，在氧糖剝奪(oxygen-glucose deprivation,OGD)模型中，選擇性拮抗劑ZM241385 與 SCH58261可以在延緩與細胞損傷高度相關(guān)的缺氧性去極化(anoxic depolarization，AD)的出現(xiàn)，并且可以減輕神經(jīng)元與星型膠質(zhì)細胞的損傷[20]。并且A2AR拮抗劑在海馬的保護作用時間窗與使用谷氨酸受體阻斷劑相同[21]，提示A2AR受體拮抗劑的作用是通過降低谷氨酸興奮性毒性實現(xiàn)。

A2AR調(diào)控細胞外谷氨酸濃度有多種機制。首先最重要的是A2AR拮抗劑可以通過突觸前谷氨酸能神經(jīng)末梢上的A2AR，從而減少谷氨酸的釋放[19]。其次，A2AR能夠調(diào)控神經(jīng)元以及膠質(zhì)細胞上的谷氨酸攝取轉(zhuǎn)運體，諸如星形膠質(zhì)細胞上表達的A2AR受體激活后可以通過調(diào)控Na+/K+-ATPase[22]，進而調(diào)控谷氨酸轉(zhuǎn)運體-1(glutamate transporter-1,GLT-1)而降低谷氨酸的再攝取，從而增加細胞外谷氨酸濃度，使用A2AR拮抗劑或敲除A2AR基因可以阻斷這一效應。再次，A1R與A2AR存在緊密的互作關(guān)系，在海馬與皮層的神經(jīng)突觸末梢，A2AR激活可通過PKC通路降低A1R的親和力從而進一步增加谷氨酸的釋放[23]。另外，A2AR受體拮抗劑可以增加GABA的細胞外濃度，從而抑制谷氨酸的釋放。選擇性A2AR激動劑可以抑制GABA的細胞外釋放，并且通過去除PKC介導的 GABA 轉(zhuǎn)運體1(GABA transporter 1,GAT-1)抑制從而增加GABA的再攝取。

A2AR除了可以調(diào)控神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞，還可以直接調(diào)控AMPA受體[24]以及NMDA受體[25]功能。在紋狀體神經(jīng)細胞膜，NMDA受體受到D2受體和A2AR形成的異聚體調(diào)控[26]。與此同時，mGlu5受體也受A2AR調(diào)控，已經(jīng)有充分的研究證明mGlu5受體能夠調(diào)控NMDA受體的功能[27]。有研究發(fā)現(xiàn)，在OGD模型引起的長時程增強(LTP)過程中， A2AR的激活能夠使AMPA受體的表達和募集增加[28]。

2.1.2 A2AR拮抗劑可以抑制損傷后絲裂原活化蛋白激酶 (MAPK)的激活以及c-fos的表達

研究表明，A2AR對轉(zhuǎn)錄以及翻譯后修飾的相關(guān)蛋白有重要的調(diào)控作用。在CNS損傷24 h后，幾乎所有的絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPK)家族成員的激活水平均顯著提高。A2AR拮抗劑可以顯著降低小膠質(zhì)細胞上 P38的磷酸化[29]。研究表明，A2AR的激活可以引起小膠質(zhì)細胞的激活，而激活的小膠質(zhì)細胞將分泌細胞毒性因子以及炎癥因子，從而啟動炎癥反應，加重神經(jīng)損傷。抑制P38的激活在OGD模型中起保護作用，并且使用A2AR拮抗劑可以有效抑制損傷后小膠質(zhì)細胞的活化以及炎癥因子IL-1β的增加[30]，因此A2AR拮抗劑可能通過抑制P38的激活從而抑制小膠質(zhì)細胞的活化。

另外，A2AR阻斷劑可以顯著降低少突膠質(zhì)細胞上JNK的磷酸化水平，而JNK激活磷酸化已經(jīng)被證實參與了少突膠質(zhì)細胞死亡，以及髓鞘損傷與錯構(gòu)。并且有研究證明，在損傷后A2AR受體拮抗劑可以通過抑制Oligo2而促進少突前體細胞(OPCs)成熟向少突膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化[31]。

與此同時，使用A2AR拮抗劑還能抑制膠質(zhì)細胞上的c-fos基因表達[32]，而Fos家族產(chǎn)物會促進炎癥相關(guān)基因的表達。

2.2 A2AR激動劑對繼發(fā)性炎性反應的作用與機制

神經(jīng)炎癥反應已經(jīng)被公認為CNS損傷繼發(fā)性損傷的首要機制[33]。在CNS損傷發(fā)生后的數(shù)分鐘至數(shù)小時，細胞外谷氨酸濃度逐漸開始劇烈上升，并激活固有免疫細胞小膠質(zhì)細胞，使其發(fā)生形態(tài)改變、增殖、遷移，并分泌炎癥因子、細胞因子等[34]。與此同時，增加的促炎因子使細胞黏附分子在血管內(nèi)皮細胞上表達增加，同時增加血腦屏障(blood-brain barrier, BBB)的通透性，從而增加了白細胞(中心粒細胞、淋巴細胞和單核細胞)在損傷區(qū)的侵潤[35]。侵潤的白細胞以中性粒為主，分泌大量的炎癥因子與趨化因子，從而進一步加重了損傷區(qū)的炎癥級聯(lián)放大效應。中性粒細胞在損傷的聚集程度，與腦組織損傷的嚴重程度、神經(jīng)功能預后密切相關(guān)[36]。

A2AR是重要的炎性調(diào)控分子，此前諸多外周組織損傷機制及創(chuàng)傷修復研究證實，激活A2AR能顯著減輕組織炎性損傷，促進傷口愈合，如減輕急性肺損傷、缺血性肝損傷、腎損傷及增加皮膚創(chuàng)面的愈合與修復。然而在CNS損傷中，既有研究觀察到激活A2AR確實得到保護效應，又有實驗觀察到了截然相反的現(xiàn)象——激活A2AR加重神經(jīng)損傷，拮抗A2AR反而能獲得保護效應。例如，在紅藻氨酸引起的腦和脊髓興奮性毒性損傷模型中均發(fā)現(xiàn)，系統(tǒng)性應用A2AR激動劑CGS21680可以引起損傷后神經(jīng)保護效應而直接局部立體注射卻無法起到保護作用。這一現(xiàn)象提示，A2AR激動劑可能不僅僅作用于“腦固有細胞”。目前一種觀點認為A2AR激動劑在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷中的保護效應的靶點是骨髓來源的細胞(bone marrow-derived cells，BMDCs)，并且A2AR激動劑CGS21680可以顯著減少損傷區(qū)BMDSs侵潤[37]，而在A2AR KO小鼠卻發(fā)現(xiàn)了更多炎細胞侵潤與神經(jīng)炎癥相關(guān)因子的表達[38]。更有意思的是，在BMDCs A2AR特異性敲除小鼠全身系統(tǒng)性應用A2AR激動劑沒有神經(jīng)保護效應，而在系統(tǒng)性A2AR敲除鼠移植有A2AR的BMDCs后恢復了神經(jīng)保護效應[16]。此外，在缺血性腦卒中[33]，脊髓創(chuàng)傷[39]、腸缺血再灌注損傷[40]等損傷中也觀察到了A2AR激動劑對繼發(fā)性炎性損傷起保護作用。

然而本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury，TBI)后激活A2AR發(fā)揮加重損傷還是神經(jīng)保護作用取決于局部谷氨酸的濃度，即：高濃度谷氨酸條件下激活A2AR加重損傷，低濃度谷氨酸條件下激活A2AR發(fā)揮保護作用，其機制是局部高濃度谷氨酸使得激活A2AR由原本抑炎的PKA信號通路向促炎的PKC通路偏轉(zhuǎn)，加重了炎癥反應，而BMDCs上的A2AR可能是谷氨酸調(diào)控A2AR的主要細胞靶標[41]。

3 中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷以A2AR為臨床干預靶點的難點探討

在神經(jīng)系統(tǒng)損傷中A2AR的效應非常復雜，激活A2AR有加重損傷與神經(jīng)保護的雙重作用。因此，腺苷A2AR矛盾效應可能涉及的機制也應當是在以A2AR為干預靶點的臨床應用中需要注意的關(guān)鍵問題。

首先，需要進一步研制高親和力、高選擇性的藥理學干預手段。A2AR的矛盾效應與傳統(tǒng)藥理學干預的局限性密切相關(guān)，尤其是阻斷劑與激動劑的選擇特異性。有文獻指出，干預 A2AR的藥理學手段一般對A1R也有一定作用，特別是高濃度使用時[42-43]。另外，已有研究證實，使用不同的藥理學干預策略可以實現(xiàn)與A1R受體形成異構(gòu)體的突觸前A2R和與D2R形成異構(gòu)體的突觸后A2R的選擇性干預[44]。

其次，需要進一步研究A2AR在不同細胞類型、不同神經(jīng)區(qū)域的效應與機制。A2AR的矛盾效應與主要效應細胞不同有關(guān)。A2AR在多種類型的細胞上表達，不同細胞類型上的A2AR可能有不同的效應，諸如現(xiàn)在血管內(nèi)皮細胞、血小板、炎細胞上表達的A2AR受體激活后，可有擴血管、抑制炎癥反應的效應，從而起到保護效應[45]。另外在神經(jīng)系統(tǒng)的不同區(qū)域，A2AR也會有不同的效應。而不同腦區(qū)的A2AR產(chǎn)生不同效應可能與A2AR表達量及偶聯(lián)的G蛋白并不同有關(guān): 在紋狀體中，A2AR高表達，并主要偶聯(lián)Golf；而在海馬、皮層，A2AR低表達，并主要偶聯(lián)Gs蛋白。另外不同的效應可能與不同信號通路介導有關(guān)，在紋狀體，A2AR的激活不是通過常規(guī)PKA途徑，而是通過PKC途徑抑制興奮性遞質(zhì)的釋放[46]。

再次，需要進一步研究A2AR在不同損傷程度以及不同發(fā)展階段的效應與機制。損傷的不同發(fā)展階段A2AR效應不同如前述，A2AR阻斷劑對早期興奮性毒性作用起保護作用，而A2AR激動劑在隨后的次級炎癥反應中有時發(fā)揮保護作用。損傷的不同嚴重程度A2AR效應不同，有文獻指出，在損傷的某一程度內(nèi)，腺苷釋放激活突觸后膜的A2AR可以與A1受體協(xié)同抑制興奮性遞質(zhì)的毒性作用可產(chǎn)生有效的神經(jīng)保護。當損傷程度過高，過高濃度的腺苷激活突觸前的A2AR，釋放大量谷氨酸從而加重損傷，而此時A2AR拮抗劑可以有效抑制興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的釋放從而起神經(jīng)保護作用[7,46]。

綜上，目前A2AR的非選擇性拮抗劑已經(jīng)被廣泛應用，諸如生活中常見的茶堿和咖啡因。并且A2AR的三維晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)在2012年成功解析，進一步促進了A2AR為靶點的化合物設計[13]。 目前以A2AR為靶點的藥物在臨床實驗的有默沙東公司的 preladenant及羅氏公司的tozadenant等。雖然A2ARs非常有潛力，但其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷中作用非常復雜，在不同的組織細胞類型，不同的損傷程度，以及不同的損傷階段都可能會產(chǎn)生不同的效應。因此如何盡可能利用A2AR拮抗劑的有利作用，并且減少負面效應，從而將其應用于臨床治療中，將是今后研究工作的重點。