MicroRNA133a在心肌纖維化中的作用機(jī)制及最新進(jìn)展

肖薩 綜述 馬丹 審校

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)科危重癥病房，黑龍江 哈爾濱 150000)

1 前言

心肌纖維化(myocardial fibrosis，MF)是心肌損傷后心臟成纖維細(xì)胞中多種炎性因子和促纖維化因子表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖并轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，進(jìn)而細(xì)胞外基質(zhì)沉積增多導(dǎo)致心室肌順應(yīng)性下降，影響心臟正常舒縮功能[1]。MF形成機(jī)制復(fù)雜，涉及腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)及多種生物介質(zhì)如轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)、結(jié)締組織生長因子(CTGF)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)、炎性因子、反應(yīng)性氧化物(ROS)、內(nèi)皮縮血管肽-1等。目前認(rèn)為，MF是多種常見心臟病如高血壓、心肌梗死、擴(kuò)張型心肌病、肥厚型心肌病及心力衰竭等向終末期心臟病發(fā)展的必然過程，是心功能由代償期向失代償期轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵時(shí)期，它對心血管疾病預(yù)后起決定性作用，也是心血管研究領(lǐng)域的重點(diǎn)、難點(diǎn)課題之一。

MicroRNA(miRs)是一類高度保守的非編碼短小單鏈RNA，研究顯示miRs可調(diào)節(jié)體內(nèi)約33%的基因，參與細(xì)胞增殖、分化、細(xì)胞代謝、細(xì)胞凋亡與血管生成等過程，直接調(diào)控心血管疾病相關(guān)靶基因[2]。近年來隨著人們對MF發(fā)病機(jī)制研究的不斷深入，miRs在纖維化潛在的生物學(xué)價(jià)值已取得一系列重要進(jìn)展。大量文獻(xiàn)顯示miR-133a是MF過程中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子之一，因其特異性表達(dá)于心臟組織，與其作用機(jī)制相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究較為廣泛，最新研究表明它不僅能作為診斷心臟疾病的潛在標(biāo)志物，還可通過對MF基因的調(diào)控抑制心臟疾病發(fā)生發(fā)展，有望成為臨床治療心血管疾病的一個(gè)新靶點(diǎn)?，F(xiàn)通過闡述miR-133a在MF發(fā)展過程中的信號傳導(dǎo)通路及其靶基因作用機(jī)制，以期為臨床診斷及治療MF提供參考指標(biāo)。

2 MiR-133a簡介

MiR-133是500多種已知哺乳動物miRs中的一種，其家族包括miR-133a-1、miR-133a-2、miR-133b，特異性表達(dá)于心臟心肌細(xì)胞及骨骼肌組織中，并且在進(jìn)化中高度保守。MiR-133與其他miRs簇集存在，通過其前體RNA的加工產(chǎn)生不同的轉(zhuǎn)錄物，進(jìn)而抑制不同的靶基因而表現(xiàn)出多種生物學(xué)功能。MiR-133a不僅被報(bào)道參與胚胎心臟發(fā)育、心臟肥大和肌肉細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)[3]，還被證實(shí)其表達(dá)水平的改變與纖維化心臟表型相關(guān)[4]。MiR-133a可抑制纖維化，增加血管形成和心肌細(xì)胞增殖，明顯改善心肌梗死大鼠心臟功能[5]，而且miR-133a可直接調(diào)節(jié)膠原蛋白α1(I)鏈表達(dá)[6]，在體外轉(zhuǎn)導(dǎo)miR-133a能使成纖維細(xì)胞中的促纖維化因子水平下調(diào)，均提示其與MF有直接聯(lián)系。Chen等[7]對糖尿病小鼠早期MF標(biāo)志物檢測發(fā)現(xiàn)：伴隨著TGF、CTGF、纖連蛋白和膠原蛋白α1的增加，miR-133a表達(dá)急劇下降，證實(shí)了miR-133a對MF及心臟功能障礙的積極預(yù)防作用。

3 MiR-133a在MF中的調(diào)節(jié)機(jī)制

3.1 MiR-133a與TGF-β/CTGF通路

TGF-β1被認(rèn)為是最強(qiáng)的促M(fèi)F的細(xì)胞因子，活化的TGF-β1可促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖、分化，促進(jìn)胞外基質(zhì)沉積；并可激活RAAS系統(tǒng)、介導(dǎo)炎癥因子白介素-6、上調(diào)氧化酶NADPH的表達(dá)產(chǎn)生等共同促進(jìn)MF進(jìn)展[8-9]。Shan等[10]在纖維化的心房模型中轉(zhuǎn)染miR-133后，TGF-β1和TGF-β2受體的水平降低，膠原蛋白合成減少，證實(shí)了miR-133a通過調(diào)節(jié)TGF-β1和TGF-β2抑制MF。

CTGF是TGF-β1的下游信號因子，且與TGF-β1具有協(xié)同作用，在MF中作為中間環(huán)節(jié)發(fā)揮作用，TGF-β1誘導(dǎo)CTGF表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞增殖趨化，使成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，通常需要Smads、蛋白激酶C、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶等信號分子級聯(lián)調(diào)節(jié)表達(dá)。實(shí)驗(yàn)證明通過敲除新生大鼠心肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中miR-133a基因，使CTGF在mRNA水平上升高超過一倍、在蛋白質(zhì)水平上升高超過三倍，相反，miR-133a過表達(dá)將顯著下調(diào)CTGF，減少膠原產(chǎn)生。而且體外研究已經(jīng)證實(shí)miR-133a能特異性結(jié)合到CTGF的3’-UTR直接影響蛋白水平[11]，表明CTGF是miR-133a在MF發(fā)展過程中的直接靶點(diǎn)。總的來說，miR-133a可以直接靶向抑制TGF-β1、CTGF的表達(dá)，并通過影響它們相互之間的作用進(jìn)一步調(diào)節(jié)膠原蛋白產(chǎn)生從而抑制纖維化。

3.2 MiR-133a與PI3K/Akt蛋白通路

PI3K/Akt信號通路普遍存在于生物體細(xì)胞內(nèi)，在促細(xì)胞分化、抗凋亡以及各種器官、組織纖維化中發(fā)揮重要作用。研究顯示TGF-β1可通過激活PI3K/Akt 信號通路促進(jìn)大鼠成纖維細(xì)胞增殖及膠原纖維增生[12]。其他細(xì)胞生長因子，如血小板源性生長因子(PDGF)、CTGF等亦可激活PI3K/Akt通路使肺成纖維細(xì)胞具有抗凋亡的能力，進(jìn)而促進(jìn)纖維化[13-14]。

最近的研究表明，心肌細(xì)胞中的信號因子-磷酸化Akt蛋白可以調(diào)節(jié)心臟功能。Sang等[15]發(fā)現(xiàn)了Akt與miR-133a的相互作用：miR-133a過表達(dá)導(dǎo)致心力衰竭大鼠心臟重量/大鼠體重和左心室舒張末期壓的降低，左心室峰值收縮壓增加，MF程度顯著降低；miR-133a抑制劑組與過表達(dá)組結(jié)果相反；而Akt抑制劑組消除了miR-133a對慢性心力衰竭大鼠的作用，即結(jié)果與過表達(dá)組相反，加劇了MF。通過實(shí)驗(yàn)說明miR-133a過表達(dá)增加了靶基因Akt的表達(dá)，Akt表達(dá)被抑制亦可阻斷miR-133a表達(dá)，從而調(diào)節(jié)心力衰竭大鼠MF。因此miR-133a與PI3K/Akt信號通路在MF的進(jìn)展中必然存在著密不可分的關(guān)系，PI3K/Akt不僅可被多種促纖維化因子激活，也可受miR-133a調(diào)節(jié)，但是miR-133a與PI3K/Akt信號通路之間具體作用靶點(diǎn)尚不確切，有待進(jìn)一步研究。

3.3 MiR-133a與Gq/PLC/IP3信號通路

MF涉及心肌肥厚、心肌細(xì)胞凋亡等一系列病理變化，Gq蛋白是去甲腎上腺素(NE)下游信號因子，與NE受體相結(jié)合調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞內(nèi)鈣通道。有活性的Gq蛋白激活磷脂酶C(PLC)，進(jìn)一步激活第二信使三磷酸肌醇(IP3)及二酰甘油(DAG)，二者導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣超載，造成心臟功能障礙和細(xì)胞凋亡[16]；而DAG可靶向激活蛋白激酶C進(jìn)一步激活RAAS系統(tǒng)導(dǎo)致MF。以前的研究證實(shí)miR-133a水平的降低與IP3誘導(dǎo)的鈣超載有關(guān)，IP3受體ⅡmRNA是miR-133a的下游靶基因，并且miR-133a水平與IP3受體Ⅱ的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)[17]。因此，Gq蛋白、IP3激活心肌細(xì)胞凋亡機(jī)制，導(dǎo)致miR-133a水平降低，加劇了MF。

最新研究發(fā)現(xiàn)miR-133a可以靶向抑制Gq蛋白，從而阻斷NE受體的多條下游信號通路，抑制大鼠心肌細(xì)胞凋亡，實(shí)驗(yàn)證明了miR-133a基因序列可結(jié)合于Gq mRNA的3’UTR區(qū)，且與對照組相比，轉(zhuǎn)染miR-133a的心肌細(xì)胞，其Gq在mRNA水平、蛋白質(zhì)水平均顯著降低[18]。Gq/PLC/IP3信號通路通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣超載導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥厚、凋亡，參與MF，miR-133a不僅可以在mRNA水平調(diào)節(jié)Gq蛋白、IP3受體Ⅱ表達(dá)，亦可在蛋白質(zhì)水平抑制Gq蛋白表達(dá)。因此Gq蛋白、IP3受體Ⅱ?qū)⒆鳛閙iR-133a在體內(nèi)保護(hù)心臟正常功能，抑制MF進(jìn)程的關(guān)鍵靶基因及直接作用靶點(diǎn)。

3.4 MiR-133a與IGF-1/Akt/GSK-3β信號通路

胰島素樣生長因子-1(IGF-1)是心臟存活、增殖和分化的重要生長因子。IGF-1參與三種主要營養(yǎng)素的代謝分解，并對心臟氧化應(yīng)激、纖維化和凋亡有保護(hù)作用[19]。大量研究表明激活A(yù)kt/糖原合成酶激酶(Akt/GSK-3β)信號通路可誘導(dǎo)心肌炎癥、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化應(yīng)激，隨后促進(jìn)MF和細(xì)胞凋亡[20-21]。Wang等通過對糖尿病性心肌病大鼠心肌組織病理學(xué)分析，證明IGF-1抑制了Akt/GSK-3β信號通路的激活，改善了糖尿病性心肌病的病理進(jìn)展[22]。經(jīng)IGF-1治療的糖尿病大鼠其代謝異常及心肌細(xì)胞凋亡減輕，間質(zhì)性纖維化、氧化應(yīng)激和炎性因子水平均下降，這表明IGF-1介導(dǎo)的Akt/GSK-3β的失活在預(yù)防MF中起關(guān)鍵作用。

實(shí)驗(yàn)證實(shí)IGF-1轉(zhuǎn)基因小鼠還可阻斷因血清反應(yīng)因子缺失所致的CTGF表達(dá)上升，從而抑制成纖維細(xì)胞增殖，明顯改善擴(kuò)張型心肌病小鼠MF和心肌細(xì)胞炎癥[23]。最近的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)miR-133a通過延長IGF-1受體mRNA的半衰期刺激IGF-1受體表達(dá)，且不阻斷IGF-1受體mRNA 3’UTR功能[24]，而且miR-133a前體可顯著刺激血管平滑肌中IGF-1受體的表達(dá)，經(jīng)miR-133a抑制劑處理后IGF-1受體水平、細(xì)胞中miR-133a含量均顯著下降。綜上，miR-133a可通過刺激IGF-1表達(dá)，抑制MF進(jìn)展，IGF-1將是miR-133a在MF治療研究中的一個(gè)關(guān)鍵作用靶點(diǎn)。

4 MiR-133a對MF治療的應(yīng)用前景

近幾年，成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化逐漸成為人們熱衷于研究的實(shí)驗(yàn)方向，其為miR-133a在纖維化中的治療提供了新的思路。研究發(fā)現(xiàn)miR-133a在老鼠心肌缺血時(shí)可以直接誘導(dǎo)原位心肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化成心肌細(xì)胞[25]。同時(shí)，最新研究表明通過GATA4等多種轉(zhuǎn)錄因子過表達(dá)，miR-1和miR-133a轉(zhuǎn)染等分子操作實(shí)現(xiàn)了人類真皮成纖維細(xì)胞向心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化，并伴隨著心臟特異性基因上調(diào)、與肌肉收縮相關(guān)途徑活化以及成纖維細(xì)胞標(biāo)志物水平降低[26]；并且實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了糖原合成酶激酶-3(GSK-3)的抑制顯著提高了轉(zhuǎn)分化的效率。這為今后治療MF提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

MiR-133a生物學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，具備分子生物標(biāo)志物的多種優(yōu)點(diǎn)，主要以游離狀態(tài)存在于外周血中，即使在強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、高溫沸騰、反復(fù)凍融等條件下也能保持穩(wěn)定狀態(tài)，可在室溫下長期儲存。而且檢測循環(huán)miR-133a的技術(shù)手段多樣化， 經(jīng)典的有Northern Blot、微陣列法、RT-PCR等檢測技術(shù)，新型檢測方法有滾環(huán)擴(kuò)增法、指數(shù)擴(kuò)增檢測法、納米金標(biāo)記技術(shù)等[27]，具有高度的敏感性和特異性，便于檢測及篩選，但是檢測成本較高仍需改進(jìn)。綜合大量實(shí)驗(yàn)及臨床研究，miR-133a在臨床治療中的應(yīng)用可從以下方面入手：對于心肌細(xì)胞中miR-133a水平下調(diào)的，可采用基因敲入、導(dǎo)入特定外源miRs或模擬物以增加靶基因表達(dá)水平[28]；也可通過調(diào)節(jié)miR-133a的直接靶作用點(diǎn)來調(diào)控MF中各大信號通路的傳導(dǎo)，以此抑制MF進(jìn)展，從而起到心臟保護(hù)的作用。

5 展望

近年來miRNA在心血管疾病中的研究已成為該領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，MF參與多種心血管疾病的進(jìn)展過程，是終末期心臟病的基礎(chǔ)病理改變，miR-133a在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)多條纖維化信號通路抑制心臟疾病的發(fā)生發(fā)展，在MF進(jìn)程中起著至關(guān)重要的作用。然而，miR-133a及其靶基因種類繁多，許多作用機(jī)制尚未明確，進(jìn)一步對信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程的深入研究不僅有助于闡明MF的發(fā)病機(jī)制，也將為MF診斷與治療帶來新的希望，而且針對miR-133a下游靶基因和其信號通路在細(xì)胞中作用位點(diǎn)的研究將為臨床防治MF提供新的理論指導(dǎo)，并能夠?yàn)閯?chuàng)新藥物的研究提供新的可能的靶位，從而為臨床開辟新的有效的治療途徑。