腎上腺皮質(zhì)癌的診斷進(jìn)展

蔣文 祝宇

腎上腺皮質(zhì)癌(adrenocortical carcinoma, ACC)是來源于腎上腺皮質(zhì)的惡性腫瘤，多發(fā)病于10歲以下的兒童和40～50歲的成人，其發(fā)病罕見(0.5～2人/100萬人)，發(fā)現(xiàn)時(shí)多已發(fā)生轉(zhuǎn)移且治療后易復(fù)發(fā)，5年生存率<35%，故早期、精確診斷對ACC的治療和預(yù)后顯得尤為重要[1]。然而一些性質(zhì)難以界定的腎上腺皮質(zhì)瘤(adrenocortical adenoma, ACA)和ACC給目前常規(guī)的內(nèi)分泌、影像學(xué)和病理學(xué)診斷方法帶來了一定的挑戰(zhàn)，隨著分子生物學(xué)和生物信息學(xué)的迅猛發(fā)展，新的“特征性基因”的發(fā)現(xiàn)為這部分的腎上腺皮質(zhì)腫瘤的診斷帶來了極大的幫助。本文將對ACC常規(guī)和新興診斷方法進(jìn)行介紹。

一、常規(guī)診斷方法

傳統(tǒng)的ACC診斷主要是在結(jié)合臨床表現(xiàn)基礎(chǔ)上，運(yùn)用內(nèi)分泌、影像學(xué)和病理學(xué)檢查手段來進(jìn)行綜合判斷的。

1.內(nèi)分泌檢查：ACC能夠分泌包括糖皮質(zhì)激素(最常見)、鹽皮質(zhì)激素、性激素及其前體等在內(nèi)的多種激素成分，ACC的臨床表現(xiàn)除了與瘤體的大小有關(guān)，還與其分泌的激素種類和水平密切相關(guān)。體積較大的腫瘤除了引起局部壓迫癥狀外，還能因腫瘤過量分泌激素引起相應(yīng)的特殊表現(xiàn)，如皮質(zhì)醇的過量分泌會引起Cushing綜合征，醛固酮的過量分泌會引起高血壓和低鉀血癥，性激素的過量分泌會引起男性的女性化和女性的男性化，根據(jù)這些特殊的臨床表現(xiàn)可以推定相應(yīng)激素分泌類型和水平，進(jìn)而為ACC提供診斷線索。歐洲腎上腺腫瘤研究網(wǎng)(European Network for the Study of Adrenal Tumors, ENS@T)建議的ACC內(nèi)分泌檢查主要由以下4個方面構(gòu)成：①糖皮質(zhì)激素：地塞米松抑制試驗(yàn)、24 h尿液游離皮質(zhì)醇、血清基礎(chǔ)皮質(zhì)醇和血清基礎(chǔ)ACTH濃度檢測；②鹽皮質(zhì)激素：血鉀濃度和醛固酮/腎素比值(僅用于高血壓或低鉀血癥患者)檢測；③性激素：血清硫酸脫氫表雄酮、17-羥基黃體酮、雄烯二酮、睪酮和17β雌二醇(男性和絕經(jīng)女性)濃度檢測；④排除嗜鉻細(xì)胞瘤相關(guān)激素檢測[2]。ACC因分化程度不高造成激素合成功能障礙，相關(guān)激素前體不能正常合成相應(yīng)激素，會導(dǎo)致過量的激素前體堆積釋放，通過激素前體的檢測不失為一種有用的診斷方法，Arlt等[3]通過分析不同患者的尿液皮質(zhì)醇代謝譜發(fā)現(xiàn)，以9種激素及前體所構(gòu)成的代謝譜作為鑒別ACC和ACA的方法，可將ACC的診斷敏感度和特異度同時(shí)提高到90%。因此除了常規(guī)的激素檢查外，通過檢測ACC的激素代謝過程的中間產(chǎn)物，可以極大提高激素檢查方法的診斷敏感度和精確度。

2.影像學(xué)檢查：CT和MRI是ACC術(shù)前診斷和術(shù)后隨訪最常用的影像學(xué)檢查手段。在CT下相較于ACA，ACC體積更大(直徑>5 cm)，密度更高，邊界呈不規(guī)則狀；當(dāng)腫瘤因生長快、營養(yǎng)供應(yīng)不足造成壞死、出血時(shí)，會表現(xiàn)為不均勻密度和不規(guī)則增強(qiáng)；當(dāng)腫瘤的壞死區(qū)域發(fā)生再生修復(fù)時(shí)，會表現(xiàn)為鈣化和囊性變；當(dāng)淋巴結(jié)向深靜脈和下腔靜脈區(qū)域轉(zhuǎn)移時(shí)，可能在相關(guān)轉(zhuǎn)移區(qū)域見到腫大淋巴結(jié)[4]。在MRI下以肝臟為參照，ACC在T1WI呈低信號，出血部位呈高信號，在T2WI呈高信號，出血部位呈低信號[5]。但對于直徑3～4 cm的包塊，利用CT和MRI對其良惡性質(zhì)界定有時(shí)比較困難。PET是另一重要的影像學(xué)檢查手段，其對轉(zhuǎn)移灶的發(fā)現(xiàn)比CT和MRI有著更高的敏感性，常用的核素包括18F、12C和123I等。由于腫瘤的代謝水平相較正常組織高，且氟代脫氧葡萄糖(FDG)作為葡萄糖類似物能夠被高代謝的腫瘤組織所吸收，一項(xiàng)對1 217人的meta分析顯示，18F-FDG PET作為鑒別ACA和ACC的檢查手段，其敏感度和特異度分別為97%、91%[6]；另一項(xiàng)含有10例ACC的研究中，18F-FDG PET/CT發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶的敏感度和特異度分別為100%、95%，而CT診斷的敏感度和特異度分別為89%、100%[7]。但部分ACA和ACC在18F-FDG PET下可表現(xiàn)為中等代謝率，對這部分中等代謝率的腎上腺皮質(zhì)腫瘤，18F-FDG PET界定其良惡性同樣顯得比較困難[8]。腎上腺皮質(zhì)能夠特異性的高表達(dá)CYP11B酶，而美托咪酯(MTO)對CYP11B酶有高度親和性，故12C-MTO PET能夠鑒別包塊和轉(zhuǎn)移灶是否為腎上腺皮質(zhì)來源，但其對ACC和ACA的區(qū)分能力尚不如18F-FDG[9]。碘甲烷(IMTO)對11β-羥化酶和醛固酮合成酶有特異性結(jié)合能力，利用123I-IMTO同樣可鑒別包塊和轉(zhuǎn)移灶是否為腎上腺皮質(zhì)來源，其敏感度和特異度分別達(dá)89%、85%[10]。因此，影像學(xué)檢查在ACC的診斷過程中發(fā)揮著舉足輕重的作用，其對于某些性質(zhì)界定困難的腎上腺皮質(zhì)腫瘤的判斷能力依然不足。

3.病理學(xué)：Weiss評分是目前最常用的ACC的病理學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)，其包括以下9項(xiàng)：核的異型性、核分裂指數(shù)≥5/50HP、核不典型分裂、透明細(xì)胞數(shù)≤25%細(xì)胞總數(shù)、彌漫性分布、腫瘤壞死、靜脈血管侵犯、竇樣結(jié)構(gòu)浸潤、包膜浸潤，每項(xiàng)為1分，總分為9分，≥3分即診斷為ACC[11]。在一項(xiàng)49例病例的研究中，利用Weiss評分作為ACC的病理診斷標(biāo)準(zhǔn)，其敏感度和特異度分別達(dá)100%、97%[12]。但Weiss評分存在一定的主觀性，會造成不同病理醫(yī)生之間的判斷差異，改良的Weiss評分近年來受到了一些病理醫(yī)生的認(rèn)同，其在Weiss評分的基礎(chǔ)上，去掉了核的異型性、彌漫性分布、竇樣結(jié)構(gòu)浸潤、包膜浸潤4項(xiàng)，將核分裂指數(shù)和透明細(xì)胞總數(shù)≤25%全部細(xì)胞兩項(xiàng)的分值調(diào)整為2分，≥3分診斷為ACC[11]。然而在對于評分為2～3分的腫瘤的性質(zhì)界定上仍存在一定的爭議，往往需要參考其他輔助病理學(xué)指標(biāo)。Ki-67是反映細(xì)胞增殖能力的重要指標(biāo)，當(dāng)Ki-67指數(shù)>5%，ACC可能性較高，其表達(dá)越高，Weiss評分也相應(yīng)越高[13]。Weiss評分作為目前的病理診斷標(biāo)準(zhǔn)存在一定主觀性判斷差異，改良的評分方法依舊因臨界分?jǐn)?shù)面臨著一些挑戰(zhàn)，因此客觀分子標(biāo)志的發(fā)現(xiàn)作為輔助診斷指標(biāo)迫在眉睫。

二、分子生物學(xué)

近年來大數(shù)據(jù)和生物信息學(xué)迅猛發(fā)展，在高通量測序的幫助下發(fā)現(xiàn)，與其他惡性腫瘤一樣，ACC是由包括基因突變、表觀遺傳、染色畸形和信號通路異常激活等在內(nèi)的多種不同基因改變引起的復(fù)雜疾病，某些特征性基因改變在ACC的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用，這些特征基因不僅為ACC的生物學(xué)行為研究和靶向藥物的研發(fā)提供方向，還對ACC診斷方法的發(fā)展起著積極的推動作用。篩選有效的特征基因成為了未來努力的方向[1]。

1.基因突變：基因突變是引起腫瘤發(fā)生的重要原因，其主要分為生殖細(xì)胞突變和體細(xì)胞突變，引起ACC的生殖細(xì)胞突變主要包括：①TP53突變：Li-Fraumeni綜合征[14]；②MEN1基因突變：多發(fā)性內(nèi)分泌腫瘤綜合征-1型[15]；③生殖細(xì)胞11p15 基因座[胰島素樣生長因子(insulin-like growth factors, IGF)-2、H19、CDKN1C]突變：Beckwith-Wiedemann綜合征[16]；④APC突變：家族性息肉性腺瘤綜合征(FAP)[17]；⑤神經(jīng)纖維瘤病1型(NF1)突變：神經(jīng)纖維瘤[18]；⑥錯配修復(fù)基因突變(MSH2、MSH6、MLH1、PMS2)：林奇綜合征[19]。目前已知的所有突變中，TP53突變是最常見的，除了引起遺傳性疾病的生殖細(xì)胞突變外，散發(fā)性ACC的TP53突變率達(dá)50%[20]。β-catenin突變僅次于TP53突變，其突變率在10%左右，ACA和ACC的β-catenin 突變率之間差別不大[21]。其他常見的突變包括ZNRF3、ATM、CDKN2A、RB1、DAXX、MED12和TERT等[1,20]。在結(jié)合家族史和臨床表現(xiàn)的基礎(chǔ)上，針對性的檢測相關(guān)突變能夠?yàn)锳CC的診斷提供一定的幫助。

2.miRNA：miRNA是由20～23個核苷酸構(gòu)成的短鏈非編碼小RNA，通過與mRNA的3′端的非翻譯區(qū)(3′-UTRs)進(jìn)行互補(bǔ)配對來抑制蛋白的翻譯，發(fā)揮調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移等作用。Koperski等[22]通過芯片檢測腎上腺腫瘤標(biāo)本發(fā)現(xiàn)，ACC中的miR-503-5p、miR-483-3p、miR-450a-5p、miR-210、miR-483-5p和miR-421的表達(dá)量與ACA存在明顯差異，進(jìn)一步通過PCR證實(shí)miR-483-3p是其中最可靠的診斷指標(biāo)。Duregon等[23]發(fā)現(xiàn)miR-483-3p、miR-483-5p和miR-210在ACC中高表達(dá)，miR-210的表達(dá)與腫瘤的壞死、Ki-67指數(shù)、IGF-1的表達(dá)呈正相關(guān)，而miR-493-3p(P=0.0191)和miR-1974(P=0.0017)與核分裂指數(shù)呈負(fù)相關(guān)。Feinmesser等[24]通過芯片分析46例腎上腺皮質(zhì)腫瘤發(fā)現(xiàn)，ACC中的miR-503高表達(dá)，而miR-34a、miR-497低表達(dá)，三者聯(lián)合應(yīng)用于ACC和ACA的鑒別診斷，其敏感度和特異度分別可達(dá)100%、96%。Szabó等[25]通過分析術(shù)前25例腎上腺腫瘤患者的血清標(biāo)本發(fā)現(xiàn)，ACC和ACA的miR-100、miR-181b、miR-184、miR-210和miR-483-5p的表達(dá)存在明顯差異，利用這些miRNA作為ACC的診斷標(biāo)志物，可以將ACC的診斷敏感度和特異度分別提高到77.8%、100%。因此結(jié)合多種miRNA的檢測為ACC和ACA的鑒別提供了可能。

3.DNA甲基化：基因轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域的CpG島甲基化會抑制該基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而抑制相關(guān)蛋白的表達(dá)。Rechache等[26]發(fā)現(xiàn)ACC的KCTD12、KIRREL、SYNGR1、NTNG2等基因的CpG島區(qū)域的甲基化水平明顯比ACA的高，聚類分析發(fā)現(xiàn)ACC與ACA的甲基化聚集區(qū)域存在較大的差異。同樣，Barreau等[27]的研究也有類似發(fā)現(xiàn)，ACC的抑癌基因如H19、PLAGL-1、G0S2、NDRG2的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域甲基化程度要比ACA高。Legendre等[28]發(fā)現(xiàn)與ACA不同的是，ACC的70%～77%低甲基化區(qū)主要集中于開放區(qū)，而40%～50%的高甲基化區(qū)域位于轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域的CpG島。Gara等[29]發(fā)現(xiàn)ACC中的甾體代謝的關(guān)鍵酶細(xì)胞色素酶P4501B1(CYP1B1)因高甲基化引起表達(dá)水平下調(diào)造成功能障礙的比例明顯要高于ACA。綜上，通過利用ACC和ACA的特定區(qū)域的甲基化水平差異不失為ACC和ACA可靠的鑒別診斷方法。

4.染色體改變：染色體的缺失、重復(fù)和易位是造成腫瘤發(fā)生的另一重要原因，通過比較基因組雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)，ACC染色體中存在多種染色體畸變。Sidhu等[30]發(fā)現(xiàn)在所有ACC和ACA中染色體改變存在明顯差異，ACC中常見染色體的改變是5(46%)、12(38%)、19(31%)和4(31%)號染色體的獲得和1p(62%)、17p(54%)、22(38%)、2q(31%)和11q(31%)號染色體的丟失，而在ACA中最常見染色體的改變是4q(22%)獲得。Stephan等[31]發(fā)現(xiàn)超過50%的ACC存在5、7、12、16q和20號染色體獲得，同時(shí)有超過20%的ACC存在1、3p、10q、11、14q、15q、17和22q號染色體的丟失。Assié等[1]發(fā)現(xiàn)ACC中存在4、5、7、8、12、16、19和20號染色體的獲得和1p、22號染色體的丟失。另一項(xiàng)包含22例ACC和24例ACA的研究中發(fā)現(xiàn)，ACC的5號染色體的獲得率較ACA明顯增高[32]。綜上可見1、5、7和12號染色體的變異在ACC中十分常見，通過檢測這些染色體的改變不失為一種ACC的診斷方法。

5.信號通路異常激活：①IGF通路：經(jīng)典的IGF信號通路主要由配體IGF-1、IGF-2，受體IGF-1R、IGF-2R以及IGF結(jié)合蛋白IGFBP 構(gòu)成復(fù)雜通路信號。IGF-1、IGF-2主要依賴IGF-1R介導(dǎo)下游來激活MAPK和PI3K以發(fā)揮促增殖、抗凋亡及維持細(xì)胞生長的作用[33]。胎兒時(shí)期的腎上腺皮質(zhì)是在ACTH誘導(dǎo)IGF-2表達(dá)的作用下分化成熟的，成熟的腎上腺皮質(zhì)分泌甾體類激素的合成需要IGF-1和IGF-2協(xié)同作用于IGF-1R。胎兒時(shí)期的腎上腺皮質(zhì)以表達(dá)IGF-2為主，而成人時(shí)期的腎上腺皮質(zhì)IGF-1和IGF-2表達(dá)水平則大致相當(dāng)[34]。在ACC中，IGF-2的表達(dá)量顯著增高，其表達(dá)水平與腫瘤的惡性程度和復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移有著密切的關(guān)聯(lián)。IGF-2基因位于染色體11p15區(qū)域，此區(qū)域還包括H19和CDKN1C基因在內(nèi)的多種基因，Beckwith-Wiedemann綜合征正是由于該區(qū)域基因發(fā)生突變引起的，同時(shí)還會造成IGF-2過度表達(dá)進(jìn)而引起下游基因的激活。Gicquel等[35]發(fā)現(xiàn)27/29(93.1%)的ACC高表達(dá)IGF-2，而在ACA中僅有3/35(8.6%)高表達(dá)IGF-2，Schmit等[36]的研究也有類似發(fā)現(xiàn)，13/17(76.5%)的ACC高表達(dá)IGF-2，僅有1/22(4.5%)的ACA高表達(dá)IGF-2。同時(shí)IGF-1R的高表達(dá)在ACC中也很常見，而在ACA中IGF-1R的高表達(dá)則比較少[37]。因此通過PCR、免疫組化等常用方法來檢測IGF信號通路相關(guān)基因的表達(dá)量，能夠?yàn)锳CC和ACA的診斷帶來極大的幫助。②Wnt信號通路：正常的Wnt/β-catenin信號通路在細(xì)胞的增殖、生存、遷移和干細(xì)胞的自我更新中起著非常大的作用。當(dāng)Wnt/β-catenin信號通路出現(xiàn)障礙時(shí)，可造成胚胎發(fā)育缺陷甚至停滯；而當(dāng)Wnt/β-catenin信號通路異常激活時(shí)則會誘發(fā)腫瘤的發(fā)生以及腫瘤的進(jìn)展[38]。腎上腺皮質(zhì)發(fā)育與功能的發(fā)揮離不開Wnt/β-catenin信號通路。ACA和ACC中都存在Wnt/β-catenin信號通路的異常激活，Tissier等[39]發(fā)現(xiàn)7/26(26.9%)的ACA和4/13(30.8%)的ACC存在β-catenin 基因突變，突變率大致相當(dāng)，但通過免疫組化分析發(fā)現(xiàn)，ACC的β-catenin陽性率(77%)明顯高于ACA(38%)；本課題組研究證實(shí)了這一點(diǎn)，20/23(87%)的ACC存在β-catenin 高表達(dá)，明顯高于ACA的13/25(52%)表達(dá)率[40]。但另外兩項(xiàng)研究卻發(fā)現(xiàn)β-catenin的表達(dá)量在ACC和ACA中差異不大[41-42]，因此通過檢測β-catenin表達(dá)量來區(qū)分ACC和ACA尚且存在爭議，需要進(jìn)一步研究來證實(shí)。③血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)信號通路：VEGF信號通路在血管生成中起到重要作用，在VEGF的作用下，其特異性受體VEGFR激活誘導(dǎo)下游轉(zhuǎn)錄因子的作用，誘使新生血管的產(chǎn)生，為腫瘤的生長和進(jìn)展提供營養(yǎng)。Kolomecki等[43]發(fā)現(xiàn)ACC患者血清中的VEGF濃度明顯高于ACA患者，而當(dāng)腫瘤切除后其濃度則會下降，說明ACC中存在VEGF高表達(dá)以維持其血液供應(yīng)。本課題組通過對20例ACA和24例ACC免疫組化分析發(fā)現(xiàn)，ACC的VEGF陽性率(70%)明顯高于ACA(25%)，證實(shí)了ACC能夠高表達(dá)VEGF[44]。因此VEGF表達(dá)量的檢測是ACC診斷的重要方向。

綜上，Weiss評分為2～3分的腎上腺皮質(zhì)腫瘤，其性質(zhì)通常介于良惡性之間，傳統(tǒng)的內(nèi)分泌、影像學(xué)、病理學(xué)檢查對其性質(zhì)的界定比較困難，在分子生物學(xué)和生物信息學(xué)的幫助下，新的”特征性基因”的改變?yōu)檫@些皮質(zhì)腫瘤的診斷提供了極大幫助。不僅簡化了診斷流程、節(jié)約了醫(yī)療資源，還為ACC治療和研究提供了更多的努力方向。但因ACC的發(fā)病率低，目前研究相對不足，一些“特征性基因”的運(yùn)用依舊存在較大的爭議，故這些基因標(biāo)志的使用價(jià)值有待更多研究來證實(shí)。