細胞死亡在肝移植缺血再灌注損傷中的研究及治療進展

錢澤，陳迪宇，吳健，鄭樹森

浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院肝膽胰外科，浙江杭州 310003

細胞死亡是一種基因指導(dǎo)的細胞自我消亡方式，一般可以由外部條件刺激觸發(fā)引起的，但在免疫調(diào)節(jié)以及免疫系統(tǒng)發(fā)育過程中，細胞死亡也可以在生理條件下發(fā)生（這種情況下，該過程又被稱為程序性細胞死亡）[1-3]。引起細胞死亡的原因很多，一切損傷因子只要作用達到一定強度或持續(xù)一定時間，從而使受損組織的代謝完全停止，就會引起細胞、組織的死亡[4,5]。細胞死亡可以根據(jù)其細胞形態(tài)學(xué)分成三類：凋亡（I類細胞死亡），自噬（II類細胞死亡）以及壞死（三類細胞死亡）。而缺血再灌注損傷作為影響移植手術(shù)患者預(yù)后的重要預(yù)后因素，引起了不少學(xué)者的研究和重視[6-7]。其中，對于細胞死亡在肝臟缺血狀態(tài)下所發(fā)揮的作用更是不容小視。但目前國內(nèi)外有關(guān)細胞死亡在肝移植缺血再灌注損傷的研究并不是很多，尚面臨諸多問題亟需解決。該文旨在通過回顧肝移植缺血再灌注損傷中各種類型細胞死亡在其中的作用機制及探討針對細胞死亡所提出的的減少缺血再灌注損傷的治療策略的可行性及其中所存在的主要問題。

1 細胞死亡在器官移植中的發(fā)生機制

對于細胞死亡的進一步深入發(fā)現(xiàn)，讓對于移植器官中細胞的變化有了新的認識。凋亡作為細胞死亡的主要形式，已經(jīng)成為腫瘤領(lǐng)域的主要研究方向，許多凋亡相關(guān)的調(diào)節(jié)藥物也開始進入臨床試驗階段，獲得較好的治療效果。移植物的缺血再灌注損傷包括冷缺血再灌注損傷、熱缺血再灌注損傷，是引起移植器官功能缺陷及移植受體預(yù)后不良的主要原因[8]。雖然引起再灌注損傷的機制相當(dāng)復(fù)雜，研究證據(jù)表明，在缺血再灌注損傷中，凋亡起到主要的調(diào)節(jié)和發(fā)生機制。

1.1 BCL-2在缺血再灌注損傷中作用

Bcl-2基因 (即B細胞淋巴瘤/白血病-2基因)是一種癌基因，它具有抑制凋亡的作用，能抑制p53介導(dǎo)的凋亡[9-11]。Bilbao等[12]運用腺病毒將bcl-2基因轉(zhuǎn)移到老鼠的肝臟，發(fā)現(xiàn)BCL-2過表達小鼠的肝臟可以顯著抵抗缺血性損傷，降低轉(zhuǎn)氨酶的釋放量，減少肝細胞的凋亡。并且在BCL-2過表達后，相對于對照組，實驗組的小鼠存活時間更長。Selzner等人[13]在轉(zhuǎn)基因小鼠中使BCL-2基因過表達，發(fā)現(xiàn)調(diào)往相關(guān)的蛋白酶caspase 3的基線水平明顯升高。Yamabe等人通過構(gòu)建小鼠缺氧模型發(fā)現(xiàn)在缺氧環(huán)境下，過表達bcl-2基因?qū)τ诟渭毎乃劳鼍哂斜Ｗo作用。

1.2 TNFα在缺血再灌注早期發(fā)揮作用

TNFα（腫瘤壞死因子）在缺血再灌注損傷中具有雙重作用[14]?？梢訲NF受體相結(jié)合，其中TNFR I中包含死亡結(jié)構(gòu)域（TRADD），與TNFα結(jié)合后可以誘導(dǎo)凋亡。TNF受體II沒有胞內(nèi)的死亡結(jié)構(gòu)域，其胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域能與抗凋亡分子相結(jié)合，例如TRAF和IAP，從而產(chǎn)生抗凋亡作用。目前，為了研究TNF的作用，常用阻斷TNFα信號通路的方法為：①使用抗TNFα的血清；②使用己酮可可堿（為甲基黃嘌呤產(chǎn)物 ，可以阻止TNF的合成以及其在Kupffer細胞中的釋放）；③使用TNF受體的基因敲除小鼠模型。使用己酮可可堿和基因敲除小鼠模型發(fā)現(xiàn)證明，通過對移植組小鼠肝臟的形態(tài)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)TNFα低表達可以在缺血再灌注損傷初期誘導(dǎo)肝細胞凋亡，說明TNF具有抵抗缺血再灌注損傷的作用。

1.3 庫普弗細胞在缺血再灌注損傷中誘導(dǎo)凋亡

在肝臟的缺血狀態(tài)時，激活的庫普弗細胞（Kupffer cell）可以增加肝細胞的再灌注損傷[15]。在激活后，庫普弗細胞可以釋放出多種潛在的危害介質(zhì)，包括TNFα、活性氧化合物。其中，在較高的活性氧化合物釋出的氧自由基濃度下，可以誘導(dǎo)脂質(zhì)發(fā)生氧化。這一效應(yīng)可以導(dǎo)致細胞膜功能障礙，從而引發(fā)細胞死亡。并且釋放的高活性氧自由基可以和TNFα結(jié)合，啟動TNFα誘導(dǎo)凋亡機制，對于實質(zhì)細胞的缺血性損傷的啟動具有重要意義。

1.4 能量代謝和離子通道改變對再灌注損傷中凋亡的影響

缺氧的刺激可以引起缺血肝臟線粒體的通透性發(fā)生改變，導(dǎo)致線粒體內(nèi)膜的跨膜電位下降，ATP合成水平顯著減少。一方面，細胞Na+/K+ATP酶活性降低，Na+/K+離子平衡紊亂，導(dǎo)致線粒體腫脹、外膜破裂釋放膜間腔內(nèi)容物包括凋亡誘導(dǎo)因子、細胞色素C等，從而引發(fā)細胞凋亡。另一方面，肝細胞內(nèi)的Ca2+-ATP酶活性也可以被抑制，當(dāng) Ca2+在細胞內(nèi)潴留，導(dǎo)致Ca2+超載，活化蛋白酶 C使 G蛋白磷酸 化，G蛋白減少，胞內(nèi) cAMP濃度減低，從而誘導(dǎo)凋亡[16]。

2 壞死性凋亡（Necroptosis）與缺血再灌注損傷

壞死性凋亡是壞死的一種特殊類型，不僅參與機體的生理性調(diào)節(jié)過程,一些具有壞死表型疾病的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后與壞死性凋亡的活化直接相關(guān)[17]。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)壞死性凋亡在缺血再灌注損傷也起到重要的作用。

2.1 壞死性凋亡在缺血再灌注損傷的發(fā)生機制

壞死性凋亡與凋亡存在共有上游調(diào)控元件，其中腫瘤壞死因子受體1（TNFR I）是其中最為深入研究的一個。在缺血條件下，TNFα被活化后可以與實質(zhì)細胞膜傷的腫瘤壞死因子受體1相結(jié)合，其結(jié)構(gòu)域中的死亡結(jié)構(gòu)域 （TRADD）可以調(diào)控下游RIPK1的表達，招募RIPK3組成壞死體（Necrosome）。并且，壞死性凋亡可以被caspase 8這個關(guān)鍵酶所調(diào)節(jié)。當(dāng)caspase 8被激活時，活化的caspase 8可以和FADD、RIPK1組裝形成誘導(dǎo)凋亡發(fā)生的復(fù)合物；而當(dāng)caspase 8活性被抑制時，RIPK1、RIPK3可以同RIP同型結(jié)構(gòu)域（RHIM）發(fā)生相互作用，引發(fā)壞死性凋亡。

2.2 壞死性凋亡與移植物免疫排斥相關(guān)

當(dāng)細胞發(fā)生在缺血狀態(tài)下發(fā)生壞死后，死細胞釋放胞質(zhì)內(nèi)容物和細胞死亡相關(guān)的模式分子(CDAMPs)，例如熱休克蛋白（HSP）、HMGB1、核酸、纖連蛋白等，這些小分子不僅可以誘導(dǎo)移植受體的早期固有免疫，還可以和Toll樣受體結(jié)合，產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)，從而加重缺血再灌注損傷及移植物的排斥反應(yīng)[18]。

3 自噬在缺血再灌注損傷中的作用

經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，肝內(nèi)的第一個細胞被IRI損傷的是肝臟竇腺狀內(nèi)皮細胞(LSEC)。更多證據(jù)表明，LSEC在肝臟應(yīng)對多種損傷時具有調(diào)節(jié)和協(xié)同作用[19]。肝細胞在缺氧缺血狀態(tài)下也可以發(fā)生自噬，使得線粒體膜和蛋白恢復(fù)，起到保護肝臟基本生命活動的作用。所以，肝臟缺氧環(huán)境下的自噬過程被越來越多的學(xué)者認為是重要的IRI細胞自我保護機制。

3.1 缺血再灌注損傷LSEC自噬激活機制

在LSEC中，自噬的上游激活通過對AMPK和ULK1信號路徑的整合來進行調(diào)節(jié)。AMPK可以在細胞缺氧狀況下感受胞內(nèi)ATP水平下降，使得細胞內(nèi)鈣離子水平升高。LSEC通過鈣離子與鈣相關(guān)蛋白結(jié)合，活化 AMPK 激酶 β（CaMKK-β）。CaMKK-β 從而可以使AMPK通路激活，并且AMPK可以磷酸化結(jié)節(jié)性硬化基因（TSC2），進一步抑制mTOR的表達，同時讓ULK1的表達量升高，從而激活自噬過程。因此，在LSEC中自噬的激活是一種AMPK與細胞內(nèi)鈣離子、AMPK、ULK1動態(tài)相互作用的結(jié)果。與此同時，肝臟血流阻斷可以引起局部組織缺氧，使得活性氧（ROS）濃度升高，激活Sirt1基因的表達。一方面，Sirt1可以將ATG5、ATG7、ATG8去乙?；?；另一方面，Sirt1也可以通過AKT途徑激活FOXO1和FOXO3，從而激活自噬過程[20-21]。

3.2 缺血再灌注損傷肝細胞自噬激活機制

Lee等人[22]通過對缺血小鼠和對照組進行比較，發(fā)現(xiàn)移植小鼠的活性氧ROS濃度增高，線粒體被氧化失活，被同位素標(biāo)記的線粒體蛋白大量溢出膜外被檢測發(fā)現(xiàn)。Khader等[23]進一步探索發(fā)現(xiàn)，缺血狀態(tài)下的移植小鼠肝細胞可以在ROS刺激下誘導(dǎo)Sirt1活化，激活自噬過程并且促進線粒體膜電位及線粒體內(nèi)相關(guān)蛋白恢復(fù)，起到減少缺血再灌注損傷的作用，對移植肝臟起到一定的保護作用。但是具體機制還有待進一步的研究。

4 抗細胞死亡治療與防治肝移植缺血再灌注損傷

4.1 抗凋亡治療

隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)研制了多種凋亡抑制劑，運用凋亡抑制劑可達到保護肝功能的目的，但對它的研究仍處于體外實驗或者動物實驗水平。其中主要包括：①蛋白水解酶抑制劑：蛋白水解酶作為凋亡通路中的關(guān)鍵分子，在缺血再灌注損傷治療顯得尤為重要。Cursio等[24]發(fā)現(xiàn)使用特異性蛋白水解酶抑制劑（Z-Asp-cmk）后，與對照組相比小鼠模型的血清轉(zhuǎn)氨酶減少了一半，而且動物的長期生存率在使用抑制劑后從30%增加到95%。而且，caspase3等凋亡相關(guān)蛋白的表達量也呈現(xiàn)出明顯降低的趨勢。②外源性cAMP的導(dǎo)入：隨著發(fā)現(xiàn)局部cAMP的濃度升高，可以顯著改善肝細胞缺血再灌注損傷，有研究將供體cAMP直接加入到小鼠肝細胞的培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)肝細胞的凋亡明顯減少，并呈現(xiàn)濃度梯度相關(guān)性。③抗氧化劑的應(yīng)用：N-乙酰半胱氨酸 (NAC)、巰基還原劑、氧化苦參堿、超氧化物歧化酶、DMPO和TEMPO等可減輕缺血再灌注時由自由基產(chǎn)生的細胞凋亡現(xiàn)象，從而減輕組織損傷。④針對BCL-2基因特異性治療：ABT-263和ABT—199是兩種已經(jīng)被FDA批準(zhǔn)的BCL-2特異性抑制劑，目前正在實體腫瘤和血液系統(tǒng)腫瘤中進行臨床試驗。該兩種藥物對于抗凋亡過程具有較好的療效，使得組織損傷程度減小[25]。⑤其他抗凋亡治療：在臨床研究中富氫氣灌流液、NO氣體保護等方法逐漸被運用到肝移植器官保存當(dāng)中，在動物實驗中取得了一定效果，但其中的機制需要進一步的探索。

4.2 抗壞死性凋亡治療

壞死性凋亡肝臟中主要通過 RIPK1、RIPK3、MLKL等幾個個關(guān)鍵基因在缺血再灌注損傷中發(fā)揮作用，對于提出了相應(yīng)的抗壞死性凋亡的治療方法：①RIPK1抑制劑：Necrostatin1是在 2005年發(fā)現(xiàn)RIPK1的特異性抑制劑，但是其分子結(jié)構(gòu)與IDO抑制劑相似，可以破壞機體的免疫耐受力，誘導(dǎo)TNF介導(dǎo)的SIRS反應(yīng)出現(xiàn)[26]。經(jīng)過化學(xué)分子結(jié)構(gòu)修飾后，Nec-1在Necrostatin1的基礎(chǔ)上消除了IDO抑制作用，Glaxo團隊使用熒光偏振分析法發(fā)現(xiàn)Nec-1可以以RIPK1特異性結(jié)合，從而抑制RIPK1和RIPK3結(jié)合形成壞死小體（necrosome），起到抑制壞死性凋亡的作用。②RIPK3抑制劑：GSK840，GSK843 ，GSK872為迄今為止發(fā)現(xiàn)的三種RIPK3抑制劑[27]，可以競爭性和RIPK3受體結(jié)合，減少壞死性凋亡的發(fā)生。但是GSK843，GSK872在高濃度狀態(tài)下可以誘導(dǎo) TNFRIPK1依賴性凋亡通路和caspase 8的激活，使得細胞凋亡增多。而GSK?840特異性最好，并且不會引起凋亡增多現(xiàn)象，值得進一步在臨床研究中進行探索。③MLKL抑制劑：GW806742X可以特異性地抑制MLKL的假激酶結(jié)合位點，從而抑制RIPK1和RIPK3結(jié)合形成壞死小體[28]。

4.3 抗自噬治療

使用NMP-L灌流的供肝和傳統(tǒng)的供肝保存方法相比可以增加ATP水平，減少肝細胞自噬產(chǎn)生。在后期對DCD供肝的研究發(fā)現(xiàn)，和2 h的傳統(tǒng)冷凍儲存肝臟相比，暴露于1 h熱缺血和2 h冷缺血后的肝臟繼續(xù)用NMP-L灌流1 h后ATP可以增加將近80%[29]。然而，對于缺血再灌注損傷中如何減少自噬產(chǎn)生仍然需要進一步的研究和探索。

5 結(jié)語

肝臟缺血再灌注損傷是影響移植肝存活率的一個重要因素，細胞死亡又與肝臟的缺血再灌注損傷有著密切的聯(lián)系，所以研究細胞死亡對于在缺血缺氧狀態(tài)下肝細胞的影響有著極為重要的意義。在缺血再灌注早期和晚期，細胞死亡可以呈現(xiàn)出不同的作用，值得我們?nèi)ミM一步探索。然而，現(xiàn)今缺血再灌注損傷的研究僅僅停留在體外實驗或者動物實驗水平上，在進入臨床使用仍需解決許多問題。但是隨著研究的不斷深入，各種類型的細胞死亡的抑制劑很有可能會呈現(xiàn)多樣化的發(fā)展，并普及運用到臨床肝臟保護當(dāng)中去，減少肝臟缺血再灌注損傷，提高肝移植成功率，改善移植患者的生存預(yù)后。