依賴解旋酶的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在手足口病檢測(cè)中的應(yīng)用研究

王曉，唐美媛

（廣西壯族自治區(qū)桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣西 桂林 541001）

0 引言

手足口病具有病情進(jìn)展速度快、發(fā)病范圍廣以及負(fù)面影響大等諸多特點(diǎn)，并且近年來其上升趨勢(shì)較為明顯[1]，其中腸道病毒71型與柯薩奇病毒A16型在手足口病的暴發(fā)流行發(fā)揮了重要作用[2-3]，發(fā)病后因感染部位不一，嚴(yán)重程度也不相同，若病情控制不及時(shí)，會(huì)出現(xiàn)危及患兒生命的嚴(yán)重后果[4]。本研究對(duì)收治手足口病兒童EV71、CA16及HFMD其他EV病原各40例標(biāo)本分別進(jìn)行依賴解旋酶恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來源和數(shù)量

本次研究選取2014年6月至2015年12月醫(yī)院收治的手足口病兒童（EV71、CA16及HFMD其他EV病原各40例）標(biāo)本。按照《手足口病預(yù)防控制指南》進(jìn)行檢驗(yàn)標(biāo)本的收集、儲(chǔ)存以及轉(zhuǎn)運(yùn)等操作。排除臨床資料不符合《實(shí)用兒科學(xué)》中診斷標(biāo)準(zhǔn)、不配合以及臨床資料欠缺的患兒，患兒年齡最小的9個(gè)月左右，年齡最大的10.1歲。

1.2 標(biāo)本采集和保存

根據(jù)不同檢驗(yàn)標(biāo)本選擇所采集的時(shí)間。發(fā)病72h內(nèi)針對(duì)患兒采集血液、皰疹液以及咽拭子標(biāo)本。采集后的標(biāo)本放-70℃冰箱保存。

1.3 儀器及方法

BSC-1500生物安全柜、K30干式恒溫儀、2720PCR儀、HYDRASY2電泳儀。試劑是美國NEB公司RT-tHDA反應(yīng)試劑盒。引物探針根據(jù)HDA技術(shù)要求從GenBank數(shù)據(jù)庫EV、EV71和CA16序列。普通RT-PCR引物序列參照《手足口病防控指南》。通過建立RT-tHDA法進(jìn)行檢測(cè)，普通擴(kuò)增產(chǎn)物通過2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)判斷結(jié)果。HDA擴(kuò)增反應(yīng)根據(jù)兩步法以及一步法的效果，確定合適的反應(yīng)程序。

1.4 技術(shù)方法評(píng)價(jià)

參照方法：普通RT-tHDA以普通RT-PCR方法作為參照進(jìn)行評(píng)價(jià)。評(píng)價(jià)指標(biāo)：特異性核酸擴(kuò)增產(chǎn)物的酶切鑒定以及序列測(cè)定；利用EV71、CA16、其他型EV做陽性、諾如病毒、輪狀病毒做陰性，檢測(cè)確定其特異性。檢測(cè)系列稀釋的已知拷貝數(shù)的RNA以確定靈敏度，檢測(cè)所有臨床標(biāo)本確定其符合率。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

將所有標(biāo)本的基本資料、研究數(shù)據(jù)均采用SPSS17.0軟件進(jìn)行分析。正態(tài)計(jì)量數(shù)據(jù)用“Mean±SD”表示，非正態(tài)數(shù)據(jù)采用Median（IQR），兩組獨(dú)立、正態(tài)、方差齊資料組間比較采用t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布的采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)；多組獨(dú)立，正態(tài)，方差齊資料組間比較采用單方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RT-tHDA的特異性

用RT-tHDA對(duì)EV71、CA16、HFMD其他EV、諾如病毒、輪狀病毒樣本進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，用腸道病毒通用反應(yīng)液檢測(cè)EV、EV71、CA16均出現(xiàn)特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，具有典型的特異條帶呈陽性，諾如病毒、輪狀病毒及陰性標(biāo)本沒有特異性擴(kuò)增產(chǎn)物呈陰性，用EV71反應(yīng)液檢測(cè)，EV71均出現(xiàn)特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，具有典型的特異條帶呈陽性，CA16、諾如病毒、輪狀病毒及陰性標(biāo)本沒有特異性擴(kuò)增產(chǎn)物呈陰性，用CA16反應(yīng)液檢測(cè)，CA16均出現(xiàn)特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，具有典型的特異條帶呈陽性，EV71、諾如病毒、輪狀病毒及陰性標(biāo)本沒有特異性擴(kuò)增產(chǎn)物呈陰性，檢測(cè)結(jié)果具有較強(qiáng)的特異性。

2.2 RT-tHDA的靈敏度和符合率

將已知RNA原液稀釋后檢測(cè)其濃度，各標(biāo)本的最低濃度為500copy/tude，具有較高靈敏度。臨床標(biāo)本通過RT-tHDA方法檢測(cè)結(jié)果與RT-PCR法檢測(cè)結(jié)果對(duì)比，陽性結(jié)果的符合率為91.28%～100.00%，平均為95.24%，陰性檢測(cè)結(jié)果符合率為100.00%。

3 討論

病毒感染性疾病目前是我國公共衛(wèi)生領(lǐng)域具有挑戰(zhàn)性的重要健康問題。臨床早期診斷是手足口病治療的第一道防線，手足口病主要是由EV71病毒或CA16病毒等多種病毒引起的，主要發(fā)生于學(xué)齡兒童，臨床可通過早期診斷、早期治療以及隔離等手段進(jìn)行有效治療[5-7]。RT-tHDA的作用機(jī)制為通過利用在早期診斷腸道病毒感染具有突出優(yōu)勢(shì)，RT-tHDA技術(shù)是模擬動(dòng)物體內(nèi)DNA的合成方式，是一種可在75～90min完成真正恒溫下進(jìn)行檢測(cè)的一種技術(shù)，具有簡便、高效的特點(diǎn)，與其他基因擴(kuò)增技術(shù)相比，可在基層醫(yī)院對(duì)手足口病進(jìn)行快速檢測(cè)提供早期診斷依據(jù)[8-10]。HDA作為新型的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，其中通過使DNA解旋酶解開DNA雙鏈，其受解旋酶的解旋速度、結(jié)合以及延伸長度所需要，臨床實(shí)際操作中模板靶序列超過400bp會(huì)使擴(kuò)增效率明顯降低，優(yōu)質(zhì)的DNA解旋酶決定了擴(kuò)增效果。本次研究中通過建立RT-tHDA方法，證實(shí)了RT-tHDA檢測(cè)法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)。

綜上所述，通過建立RT-tHDA方法可在2h內(nèi)完成檢測(cè)工作，作為臨床針對(duì)手足口病的快速檢測(cè)方法可有效提供第一道防護(hù)屏障，經(jīng)濟(jì)適用性高以及對(duì)設(shè)備要求低，在基層醫(yī)院較為適用，值得臨床推廣并廣泛應(yīng)用。

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