益氣去喘湯微生物限度檢查方法驗(yàn)證試驗(yàn)

陳俊濤

[摘要]目的通過(guò)篩選合理的檢查方法，為益氣去喘湯提供正確的微生物限度檢查標(biāo)準(zhǔn)。方法以據(jù)《中國(guó)藥典》2015年版規(guī)定，分別采用常規(guī)法、平皿法、培養(yǎng)基稀釋法對(duì)樣品進(jìn)行微生物限度試驗(yàn)。結(jié)果平皿法.對(duì)大腸埃希菌、白色念珠菌、黑曲霉的回收率均能達(dá)到要求；培養(yǎng)基稀釋法（0.5mL/皿）對(duì)金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的回收率能達(dá)到要求；對(duì)大腸埃希菌、沙門(mén)菌的檢查方法可使用常規(guī)方法進(jìn)行檢查。結(jié)論試驗(yàn)中選擇的酵母菌、細(xì)菌、霉菌的計(jì)數(shù)方法，以及控制菌所選用的驗(yàn)證方法適用于益氣去喘湯的微生物限度檢查，本試驗(yàn)可達(dá)到檢測(cè)目的。

[關(guān)鍵詞]益氣去喘湯；微生物限度檢查；驗(yàn)證試驗(yàn)；制訂檢查標(biāo)準(zhǔn)

[中圖分類(lèi)號(hào)]R286.0 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]2095-0616（2017）17-43-05

益氣去喘湯是我院多年臨床經(jīng)驗(yàn)處方，主要由黃芪、黨參、枇杷葉、前胡、桔梗、杏仁等藥物組成的，具有益氣、宣肺、化痰、平喘等功效，治療肺氣虛引起的哮喘、咳嗽等癥狀，療效顯著，安全可靠，無(wú)明顯副作用。在制劑檢驗(yàn)過(guò)程中，為保證微生物限度檢查的科學(xué)性和準(zhǔn)確性，以及確保本試驗(yàn)選擇的檢測(cè)方案適用于益氣去喘湯中霉菌、酵母菌、細(xì)菌計(jì)數(shù)的檢測(cè)，以及控制菌的檢定，該驗(yàn)證方案采用《中國(guó)藥典》2015年版一部附錄XⅢc微生物限度檢查方法進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果報(bào)道如下。

1試驗(yàn)材料

1.1試藥

益氣去喘湯由本院煎藥室負(fù)責(zé)供應(yīng)。

1.2試驗(yàn)所需的培養(yǎng)基

營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基、膽鹽乳糖培養(yǎng)基、改良馬丁培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基等。上述所用的培養(yǎng)基均系北京三藥科技開(kāi)發(fā)公司生產(chǎn)。

1.3本試驗(yàn)所用菌種

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）[CMCC（B）63501]、大腸埃希菌（Escherichia coli）[CMCC（B）44102]、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B）26003]、黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC（F）98003]、白色念珠菌（Candida albicans）[cMCC（F）98001]、乙型副傷寒沙門(mén)菌（Salmonellaparatyphi B）[CMCC（B）50094]?？莶菅挎邨U菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、黑曲霉、白包念珠菌、乙型副傷寒沙門(mén)菌均由中國(guó)醫(yī)學(xué)菌種保藏中心提供。

2試驗(yàn)驗(yàn)證步驟

2.1試驗(yàn)所用菌液的配制

2.1.1吸取在35℃經(jīng)過(guò)24h培養(yǎng)的枯草芽孢桿菌、金黃葡萄球菌、沙門(mén)菌、大腸埃希菌的肉湯培養(yǎng)物1mL，使用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液10倍量進(jìn)行稀釋?zhuān)莶菅挎邨U菌至10^-5、金黃色葡萄球菌至10^-7、沙門(mén)菌至1@8，大腸埃希菌至10-7、大約50～100cfu/mL，以備試驗(yàn)使用。

2.1.2吸取在26℃經(jīng)過(guò)24h培養(yǎng)的白色念珠菌液體培養(yǎng)物1mL，使用0.9%氯化鈉無(wú)菌溶液10倍量進(jìn)行稀釋到10^-5，大約50～100cfu/mL，以備試驗(yàn)使用。

2.1.3吸取在26℃經(jīng)過(guò)7d培養(yǎng)的黑曲霉的改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)物，加5mL含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的0.9%氯化鈉無(wú)菌溶液，洗脫掉孢子。再吸取出含孢子的混懸液，加0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的0.9%氯化鈉無(wú)菌溶液10倍量進(jìn)行稀釋到104，大約50～100cfu/mL，以備試驗(yàn)使用。

以上所使用的各株菌的培養(yǎng)物都是三代培養(yǎng)物。

2.2試驗(yàn)所用菌液的測(cè)定

2.2.1吸取以上枯草芽孢桿菌10^-5、金黃葡萄球菌10^-7、沙門(mén)菌10^-8、大腸埃希菌10^-7級(jí)稀釋后的溶液的量分別為1mL，使用45℃營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基20mL分別注皿，并分別進(jìn)行平行測(cè)定此二皿，調(diào)溫至35%，靜止48h后計(jì)算菌落數(shù)，大約50～100cfu/mL。測(cè)定的結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2.2分別吸取以上配制的含黑曲霉104的孢子混懸溶液1mL、白色念珠菌10^-5稀釋溶液1mL，再取45℃玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基20mL分別進(jìn)行注皿后，然后再分別平行測(cè)定此二皿，調(diào)溫至26%，靜止培養(yǎng)，每日觀察，計(jì)算菌落數(shù)，大約50～100cfu/mL。測(cè)定的結(jié)果見(jiàn)表1。

2.3試驗(yàn)驗(yàn)證霉菌、酵母茵、細(xì)菌的計(jì)數(shù)方

依據(jù)《中國(guó)藥典》2015年版一部（附錄XⅢC）微生物限度檢查法中計(jì)算菌落數(shù)的方法進(jìn)行驗(yàn)證測(cè)定。試驗(yàn)所用供試溶液的配制：量取供試藥液10mL，緩緩加入氯化鈉一蛋白胨無(wú)菌緩沖溶液至100mL，調(diào)至pH7.0，用玻棒攪拌混合均勻，此為供試溶液備用。

2.3.1平皿法結(jié)果見(jiàn)表2～6。

2.3.1.1試驗(yàn)組 分別吸取上述供試溶液，按每個(gè)皿為1mL的量加入供試溶液，再加入上述已配制好的試驗(yàn)菌50～100cfu，隨即傾入瓊脂培養(yǎng)基，放在規(guī)定的溫度下靜止3～5d，每天按時(shí)觀察。

2.3.1.2菌液組 將相同體積的供試溶液換成氯化鈉-蛋白胨無(wú)菌緩沖溶液（pH7.0），以照試驗(yàn)組的方法進(jìn)行驗(yàn)證檢測(cè)。

2.3.1.3試驗(yàn)對(duì)照組 對(duì)照組的試驗(yàn)方法除不加菌液外，其他均與試驗(yàn)組相同。

2.3.1.4計(jì)算試驗(yàn)組的加菌回收率 根據(jù)下述計(jì)算公式計(jì)算回收率。

試驗(yàn)組的加菌回收率=（試驗(yàn)組的平均菌落數(shù)-供試品對(duì)照組的平均菌落數(shù)）/菌液組的平均菌落數(shù)×100%。

2.3.2培養(yǎng)基稀釋法結(jié)果見(jiàn)表5～6。

2.3.2.1試驗(yàn)組 分別吸取上述供試溶液，按每個(gè)皿為0.5、0.2mL的量注入平皿，再注入上面已配制好的試驗(yàn)菌50-100cfu，隨即傾入瓊脂培養(yǎng)基，放在規(guī)定的溫度下靜止3～5d，每天按時(shí)觀察。

2.3.2.2菌液組 測(cè)定方法與平皿法的菌液組相同。

2.3.2.3供試品對(duì)照組 試驗(yàn)方法僅不加菌液之外，其他均與試驗(yàn)組相同。

2.3.2.4計(jì)算試驗(yàn)組的加菌回收率 根據(jù)下述計(jì)算公式計(jì)算回收率。

試驗(yàn)組的加菌回收率=（試驗(yàn)組的平均菌落數(shù)-供試品對(duì)照組的平均菌落數(shù)）/菌液組的平均菌落數(shù)×100%。

2.4驗(yàn)證控制菌的測(cè)定方法

2.4.1驗(yàn)證大腸埃希菌的測(cè)定方法 根據(jù)常規(guī)法進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)數(shù)據(jù)如表7。

2.4.1.1試驗(yàn)組 在膽鹽乳糖培養(yǎng)基中加入供試溶液，按每100mL膽鹽乳糖培養(yǎng)基中加入供試溶液10mL，再注入上面已配制好的大腸埃希菌50～100cfu，放在35℃溫度下靜止24h，根據(jù)相應(yīng)控制菌的測(cè)定方法進(jìn)行試驗(yàn)。

2.4.1.2陰性試驗(yàn)對(duì)照組 將相同體積的供試溶液換成氯化鈉一蛋白胨無(wú)菌緩沖溶液（pH7.0），試驗(yàn)方法僅不加菌液之外，其他均與試驗(yàn)組相同。

2.4.1.3陽(yáng)性試驗(yàn)對(duì)照組 將相同體積的供試溶液換成氯化鈉一蛋白胨無(wú)菌緩沖溶液（pH7.0），其他試驗(yàn)方法均與試驗(yàn)組相同。

2.4.1.4供試品組 在膽鹽乳糖培養(yǎng)基中加入供試溶液，按每100mL膽鹽乳糖培養(yǎng)基中加入供試溶液10mL，放在35℃溫度下靜止24h，根據(jù)相應(yīng)控制菌的測(cè)定方法進(jìn)行試驗(yàn)。

2.4.2驗(yàn)證沙門(mén)菌的測(cè)定方法 根據(jù)常規(guī)法進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)數(shù)據(jù)如表7。

2.4.2.1試驗(yàn)組 在營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中加入供試品，按每200mL營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中加入供試品10g，使其混合均勻，再加入上面已配制好的沙門(mén)菌50～100cfu，放在35℃溫度下靜止24h，根據(jù)相應(yīng)控制菌的測(cè)定方法進(jìn)行試驗(yàn)。

2.4.2.2陰性試驗(yàn)對(duì)照組 吸取上述營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基200mL，放在35℃溫度下靜止培養(yǎng)24h，根據(jù)相應(yīng)控制菌的測(cè)定方法進(jìn)行試驗(yàn)。

2.4.2.3陽(yáng)性試驗(yàn)對(duì)照組 在營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中加入沙門(mén)菌，按每200mL營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中加入沙門(mén)菌50～100cfu，使其混合均勻，放于35℃溫度下靜止24h，根據(jù)相應(yīng)控制菌的測(cè)定方法進(jìn)行試驗(yàn)。

2.4.2.4供試品組 在營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中加入供試品，按每200mL營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中加入供試品10g，使其混合均勻，放于35℃溫度下靜止24h，根據(jù)相應(yīng)控制菌的測(cè)定方法進(jìn)行試驗(yàn)。

3討論

3.1驗(yàn)證方法可用

在驗(yàn)證霉菌、細(xì)菌、酵母菌數(shù)的檢查方法試驗(yàn)中，根據(jù)試驗(yàn)表2～6中的數(shù)據(jù)可知，平皿法對(duì)白色念珠菌、大腸埃希菌、黑曲霉的回收率均大于70%，都達(dá)到《中國(guó)藥典》2015年版一部附錄XⅢc微生物限度的要求，對(duì)金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的回收率均小于70%；采用培養(yǎng)基稀釋法（0.5mL/皿），對(duì)金黃色葡萄球菌的回收率能達(dá)到要求；采用培養(yǎng)基稀釋法（0.2mL/皿），對(duì)枯草芽孢桿菌的回收率能達(dá)到要求；在驗(yàn)證沙門(mén)菌和大腸埃希菌的檢查方法試驗(yàn)中，根據(jù)表7中的數(shù)據(jù)可知，陰性對(duì)照組和供試品組未檢出控制菌，而試驗(yàn)組和陽(yáng)性對(duì)照組均檢出控制菌，因此，對(duì)沙門(mén)菌和大腸埃希菌可采用常規(guī)法進(jìn)行檢查。

3.2驗(yàn)證結(jié)果可靠

從上述試驗(yàn)結(jié)果可知，對(duì)益氣去喘湯進(jìn)行微生物限度檢查時(shí)，可以用培養(yǎng)基稀釋法（0.2mL/皿）對(duì)細(xì)菌數(shù)進(jìn)行測(cè)定，可以用平皿法對(duì)霉菌、酵母菌數(shù)進(jìn)行測(cè)定，可以用常規(guī)法對(duì)沙門(mén)菌、大腸埃希菌進(jìn)行檢查。

3.3驗(yàn)證目的達(dá)到

根據(jù)上述結(jié)論，制訂出益氣去喘湯的微生物限度檢查標(biāo)準(zhǔn)，具體為：吸取該湯藥加氯化鈉一蛋白胨的無(wú)菌緩沖液（pH7.0）配制為1：10的供試液。細(xì)菌的計(jì)數(shù)使用培養(yǎng)基稀釋法（0.2mL/皿）進(jìn)行檢查，霉菌和酵母菌的計(jì)數(shù)使用平皿法檢查，沙門(mén)菌、大腸埃希菌的檢查用常規(guī)法，結(jié)果應(yīng)符合《中國(guó)藥典》2015年版一部附錄XⅢC微生物限度的規(guī)定。

（收稿日期：2017-06-01）