中藥提取物體外抑殺犬螨蟲試驗(yàn)

田其真，蔡丙嚴(yán)，封家旺

(1.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇泰州 225300；2.西藏職業(yè)技術(shù)學(xué)院，西藏拉薩 850036)

犬螨蟲感染是寵物臨床上常見的一種以皮膚瘙癢、滲出性炎癥及高度接觸性傳播為特征的頑固性體外寄生蟲病[1]。犬螨蟲通常分為蠕形螨、疥螨、癢螨3種類型，其感染犬后復(fù)發(fā)率高、較難治愈，嚴(yán)重影響了犬的生長發(fā)育和生活質(zhì)量，同時(shí)也威脅人類的健康[2]。目前，犬螨蟲病的治療主要采取化學(xué)藥物治療，由于部分藥物對(duì)蟲卵無效，對(duì)幼蟲效果不佳，而殺蟲藥效只能維持10 d左右，必須經(jīng)過2次～3次14 d～28 d的治療，才能徹底殺滅螨蟲[3]。因此，研制廣譜、高效、無殘毒、經(jīng)濟(jì)、方便，尤其是適用于寵物醫(yī)院及基層獸醫(yī)站使用和推廣的殺蟲藥十分必要。中藥有較強(qiáng)的抗菌、抗病毒和殺滅多種寄生蟲效果，近年來，應(yīng)用單味中藥及復(fù)方藥物治療螨病的報(bào)道日益增多，一些中藥也已被相繼開發(fā)為商業(yè)殺螨劑[4-5]。本試驗(yàn)采用中藥提取物與離體螨蟲成蟲直接接觸法，比較了8種中藥不同提取物對(duì)犬螨蟲的體外抑殺效果，為篩選出對(duì)犬螨蟲作用明顯的中藥活性部位，指導(dǎo)寵物臨床合理用藥，同時(shí)為研制新型殺犬螨蟲制劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物 苦楝皮、椿皮、蛇床子、小茴香、藜蘆、白鮮皮、羊蹄根、狼毒等，購自泰州市仁濟(jì)中藥飲片公司；液體石蠟，上海國藥集團(tuán)產(chǎn)品；10 mg/mL伊維菌素注射液，吉林省康達(dá)動(dòng)物藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，批號(hào)20160301。

1.1.2 犬螨蟲樣本 犬蠕形螨35份，疥螨17份，耳癢螨18份，分別采集于泰愛牧寵物醫(yī)院、江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院教學(xué)動(dòng)物醫(yī)院臨床確診的患犬病料。

1.1.3 儀器設(shè)備 多功能植物粉碎機(jī)(CSJ型),旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀型號(hào)(IKA RV8),光學(xué)顯微鏡(奧林巴斯CX31),微量移液器(Thermo),電子天平(FA1004N)等。

1.2 方法

1.2.1 中藥提取物的制備 將上述8種中藥各取100 g，分別用多功能植物粉碎機(jī)打碎，然后浸泡0.5 h。將苦楝皮、椿皮、蛇床子、小茴香4種中藥及浸漬液分別裝入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，然后煎汁蒸餾，收集蒸餾液，將剩余蒸餾液過濾去渣，用500 mL/L乙醇沉淀48 h，回收乙醇至無醇味，將蒸餾液與醇沉液合并即得4種中藥的提取物。將藜蘆、白鮮皮、羊蹄根、狼毒4種中藥浸漬液，分別水煎2次，過濾，2次濾液合并濃縮。8種中藥生藥含量均為1 g/mL，高壓滅菌后置4℃冰箱備用。

1.2.2 體外抑殺螨蟲試驗(yàn) 將螨蟲樣本按類別隨機(jī)分為1組～10組，每組7份，1組～8組為中藥提取物試驗(yàn)組，9組為10 mg/mL伊維菌素陽性藥物對(duì)照組，10組為液體石蠟空白對(duì)照組，采用直接接觸法進(jìn)行體外抑殺螨蟲試驗(yàn)。先將螨蟲樣本置于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔7份，然后用微量移液器吸取8種中藥提取物滴加于細(xì)胞培板中，每孔0.1 mL，對(duì)照孔分別加入10 mg/mL伊維菌素和液體石蠟，每孔0.1 mL。將24孔細(xì)胞培養(yǎng)板置于溫度為25℃～28℃，相對(duì)濕度70%～80%的培養(yǎng)箱中作用，每隔1 h取出在高倍顯微鏡下觀察螨蟲螯肢與足爪的運(yùn)動(dòng)情況，每次觀察時(shí)間1 min，直至所有螨蟲死亡為止。死亡判定標(biāo)準(zhǔn)[6]：①蟲體收縮或透明者；②蟲體破裂，外周有油滴樣堆積物者；③在高倍鏡下連續(xù)觀察1 min，蟲體或蟲足不活動(dòng)者。

2 結(jié)果

8種中藥提取物體外抑殺犬螨蟲效果見表1。從表1 可以看出，上述8種中藥提取物對(duì)犬螨蟲均有較好的抑殺作用，其中蒸餾與醇沉混合中藥提取物中，小茴香的效果最好，其完全殺滅螨蟲時(shí)間為作用后4 h，其次為蛇床子，完全殺螨時(shí)間為6 h。水提取物中，以羊蹄根的完全殺滅螨蟲時(shí)間最短，為作用后的5 h。上述3種中藥提取物的完全殺滅犬螨蟲所需時(shí)間均小于10 mg/mL伊維菌素陽性藥物對(duì)照組的8 h，而椿皮、藜蘆提取物的作用時(shí)間與10 mg/mL伊維菌素相同均為作用后的8 h。

表1 8種中藥提取物體外抑殺犬螨蟲效果

注：“-”表示在此時(shí)間未統(tǒng)計(jì)螨蟲存活數(shù)量。

Note: "-" Indicates that the survival numberof mites is not counted at this time.

3 討論

小茴香,為傘形科植物茴香的干燥成熟果實(shí)。其味辛，性寒，具有散寒止痛，理氣和胃作用[7]?；瘜W(xué)成分含揮發(fā)油，對(duì)真菌孢子有抑制作用[8]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，小茴香蒸餾與醇沉混合提取物體外具有較強(qiáng)的抑殺犬螨蟲作用。蛇床子，為傘形科植物蛇床的干燥成熟果實(shí)。其味辛、苦，性溫，有小毒，具有溫腎壯陽，祛風(fēng)燥濕，殺蟲止癢功效[9]。果實(shí)含揮發(fā)油，體外試驗(yàn)對(duì)須發(fā)癬菌有較強(qiáng)的活性[10]。楊海燕等[11]用蛇床子水煎劑觀察了體外抑殺犬螨蟲效果，作用8 h后可完全抑殺犬螨蟲，而本試驗(yàn)用的是蒸餾與醇沉混合提取物，其對(duì)犬螨蟲完全抑殺時(shí)間為作用后的6 h，比水煎劑縮短2 h。羊蹄根，為植物蓼科皺葉酸?；蜓蛱愕母Ｆ湮犊?、酸，性寒。化學(xué)成分為大黃酸、大黃素等，對(duì)多種細(xì)菌及小孢子霉菌具有顯著抑制作用[12]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，小茴香、羊蹄根、蛇床子3種中藥提物對(duì)犬螨蟲體外有顯著的抑殺作用，效果優(yōu)于伊維菌素。

寵物臨床上對(duì)于犬蠕蟲的治療,常選用外用藥物如雙甲脒涂擦或藥浴，皮下注射藥物如伊維菌素等，雖具有較好的殺滅效果，但對(duì)于吉娃娃、柯利血統(tǒng)的犬等較為敏感，可引起嘔吐、過敏等副作用甚至中毒[13]。而中藥防治犬螨蟲病具有安全、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)。目前，純中藥殺犬螨蟲的制劑種類不多，本試驗(yàn)中的小茴香、蛇床子、羊蹄根等中藥提取物抑殺犬螨蟲效果顯著，且藥品來源易得，制備方法簡單，在后續(xù)臨床療效試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，研制新的殺犬螨蟲制劑，將有良好的市場(chǎng)開發(fā)前景。

目前，體外抑殺犬螨蟲試驗(yàn)多采用藥物與離體螨蟲成蟲直接接觸法[14]。應(yīng)用此方法應(yīng)注意幾點(diǎn)，以確保試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確度。首先，活螨蟲樣本的分離及保存較為困難，要選取臨床上典型病例進(jìn)行分離且有充足的螨蟲數(shù)量，分離完后立即進(jìn)行試驗(yàn)操作。其次，螨蟲與藥物添加量要嚴(yán)格控制，藥量過少影響藥物對(duì)螨蟲的充分接觸，藥量過大，影響藥物的實(shí)際作用效果，一般以24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入螨蟲應(yīng)在5只以上，藥液添加0.1 mL比較合適。再次，藥物與螨蟲作用后要設(shè)置合適的作用溫度、濕度以滿足螨蟲存活最適宜的條件。通常將培養(yǎng)箱溫度設(shè)為25℃～28℃，調(diào)節(jié)相對(duì)濕度為70%～80%。最后，顯微鏡觀察判定藥物作用療效時(shí)，應(yīng)用100倍或400倍鏡觀察，仔細(xì)查看螨蟲的鰲肢與足爪的運(yùn)動(dòng)情況，連續(xù)觀察1 min以上，直至所有螨蟲死亡為止，在時(shí)間充足的情況下，在藥物作用后的2 h，可每隔30 min觀察一次，有利于比較各種藥物作用效果的差異。

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