防霉劑脫氫醋酸鈉致大鼠出血試驗(yàn)

余崢嶸，吳銀超，謝佳玉，謝 陽(yáng)，李 楠，魯倩倩，張雨梅,2*

(1.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009;2.江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇揚(yáng)州 225009)

脫氫醋酸鈉(sodium dehydroacetate)對(duì)多種霉菌、酵母菌、細(xì)菌具有較好的抑制作用，是聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(FAO)和世界衛(wèi)生組織(WHO)批準(zhǔn)使用的一種食品防腐劑。我國(guó)《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》(GB 2760—2014)規(guī)定其在食品中的一般使用量為0.3 g/kg～0.5 g/kg。被廣泛應(yīng)用于各類食品如醬油、醬菜、果汁、面包、蛋糕、廣式月餅、人造奶油和腐乳、米面制品、月餅、湯料及飲料、魚肉類、乳制品、豆制品、醬油等的防腐防霉[1-4]，也可用于農(nóng)產(chǎn)品的保鮮、飼料的防霉及化妝品、藥物等的防腐[5-6]。

有關(guān)脫氫醋酸鈉的毒性研究表明，大鼠經(jīng)口LD50為1 000 mg/kg體重，小鼠經(jīng)口LD50為1 330 mg/kg體重。脫氫醋酸鈉對(duì)大鼠的亞慢性毒性試驗(yàn)表明，大鼠連續(xù)每日服用脫氫醋酸鈉300 mg/kg，動(dòng)物逐漸表現(xiàn)出食欲消退、體重減輕、胃黏膜不同程度出血、血中尿素氮含量升高等不同癥狀[7-8]。近年來(lái)還有脫氫醋酸鈉引起過(guò)敏的報(bào)道[9-11]。

Yamashoji S等[12]檢測(cè)脫氫醋酸鈉對(duì)NIH/3T3和神經(jīng)-2a細(xì)胞的IC50值分別為0.44 g/L和0.55 g/L，進(jìn)而推算出脫氫醋酸鈉的每日允許攝入量(ADI)為0.5 g/kg。而Priputina L S等[13]根據(jù)脫氫醋酸鈉對(duì)大鼠的試驗(yàn)結(jié)果，推薦ADI為0.013 mg/kg。目前為止，WHO和食品添加劑聯(lián)合專家委員會(huì)(JECFA)等權(quán)威機(jī)構(gòu)均未發(fā)布脫氫醋酸鈉的ADI。本文通過(guò)經(jīng)口紿予大鼠不同劑量脫氫醋酸鈉，測(cè)定凝血酶原時(shí)間(prothrombin time，PT)和活化部分凝血酶原時(shí)間(activated partial thromboplastin time，APTT)，以及組織病理學(xué)分析，研究脫氫醋酸鈉對(duì)大鼠可能導(dǎo)致的出血傾向,為脫氫醋酸鈉作為食品、飼料添加劑的使用安全性評(píng)價(jià)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Wistar大鼠，體重180 g～200 g，公母各半，由揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心提供。動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(蘇)2012—0004，使用許可證號(hào)：SYXK(蘇)2012—0029。飼喂經(jīng)60Co照射飼料，24℃±2℃，濕度60%±20%，飲水為符合城市飲用水標(biāo)準(zhǔn)的自來(lái)水。試驗(yàn)前在實(shí)驗(yàn)環(huán)境中適應(yīng)3 d，不限制飲水。

1.1.2 試劑與儀器 脫氫醋酸鈉(純度99.8%) ， 江蘇天成動(dòng)物保健公司產(chǎn)品；PT測(cè)定試劑盒(凍干型)、APTT測(cè)定試劑盒(鞣花酸)，上海太陽(yáng)生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，4℃保存?zhèn)溆?；戊巴比妥鈉、檸檬酸三鈉，上海市蘇懿化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。

TRON M4凝血儀，德國(guó)TECO Gmbh公司產(chǎn)品；切片機(jī)、倒置顯微鏡，德國(guó)Leica公司產(chǎn)品；高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司產(chǎn)品；Synergy小型純水系統(tǒng)，美國(guó)默克密理博公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 分組與處理 Wistar大鼠，隨機(jī)分成5組，公母各半。試驗(yàn)分組分別為脫氫醋酸鈉50、100、150、200 mg/kg組，對(duì)照組生理鹽水。按1 mL/100 g體重灌胃給予，連續(xù)12 d。分別于第5、7、9、11、13、15天，每組大鼠公母各4只，經(jīng)20 mg/mL戊巴比妥鈉麻醉后腹主動(dòng)脈采集血液用于PT和APTT測(cè)定。于第13天處死后剖檢大鼠，觀察內(nèi)臟有無(wú)眼觀病理變化，并取心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟等器官，固定后HE染色進(jìn)行組織病理學(xué)觀察。

1.2.2 體重及飼料消耗的測(cè)定 分別在給藥后的第1、3、7、10、13天稱取大鼠體重，并計(jì)算飼料消耗量。

1.2.3 PT和APTT的測(cè)定

Linsanity：翻譯為中文是林書豪熱、林瘋狂。這個(gè)詞就是：林書豪的姓的首字母L+insanity(瘋狂)組合起來(lái)的新詞。當(dāng)時(shí)Jeremy Lin 的表現(xiàn)越來(lái)越神勇了，剛拿下NBA東部一周最佳球員稱號(hào)，又在與猛龍的對(duì)決中最后0.5秒3分絕殺帶領(lǐng)球隊(duì)取得了六連勝。球迷們用新詞“Linsanity”來(lái)對(duì)林書豪人氣進(jìn)行概括。

1.2.3.1 大鼠血漿的制備 血液與31.3 mg/mL檸檬酸酸鈉按9∶1比例混勻，靜置15 min～30 min后，3 500 r/min離心10 min。所得血漿按試劑盒說(shuō)明書立即進(jìn)行PT、APTT測(cè)定。

1.2.3.2 PT的測(cè)定 取大鼠待測(cè)血漿50 μL至樣品杯中，放入血凝儀，37℃孵育3 min， 加入37℃預(yù)溫的PT試劑100 μL，記錄凝血酶原時(shí)間即為PT值。

1.2.3.3 APTT的測(cè)定 取大鼠待測(cè)血漿50 μL至樣品杯中，加入37℃預(yù)溫的APTT試劑50 μL，37℃孵育5 min。再加入37℃預(yù)溫的0.025 mol/L CaCl2溶液50 μL，記錄部分促凝血酶原時(shí)間即為APTT值。

1.2.4 組織病理學(xué)觀察 將采集的大鼠心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟，用40 g/L甲醛固定后，按常規(guī)方法進(jìn)行石蠟切片的制備。經(jīng)HE染色后，顯微鏡下觀察組織的病理學(xué)變化。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 脫氫醋酸鈉對(duì)大鼠體重和飼料消耗的影響

2.1.1 脫氫醋酸鈉對(duì)大鼠體重的影響 不同劑量脫氫醋酸鈉對(duì)大鼠體重的影響見(jiàn)表1。

由表1可以看出，與正常組比較，50 mg/kg組雄性大鼠在用藥期間與正常組大鼠體重相當(dāng)；而100、150、200 mg/kg組，在給予脫氫醋酸鈉10 d 后，雄性大鼠體重顯著降低(P<0.05)。100 mg/kg～200 mg/kg組雄性大鼠試驗(yàn)期內(nèi)總增重均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。雌性大鼠在給予脫氫醋酸鈉7 d后體重均低于對(duì)照組，50、150、200mg/kg組差異顯著(P<0.05)；100 mg/kg組在10 d 后也顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。50 mg/kg和100 mg/kg組總增重顯著低于對(duì)照組，150 mg/kg和200 mg/kg組在用藥期間體重負(fù)增長(zhǎng)。

2.1.2 脫氫醋酸鈉對(duì)大鼠飼料消耗的影響 不同劑量脫氫醋酸鈉對(duì)大鼠飼料消耗的影響見(jiàn)表2。

由表2可以看出，在用藥第3天后，脫氫醋酸鈉各組大鼠飼料消耗均低于正常組，差異顯著(P<0.05)。隨著用藥時(shí)間的延長(zhǎng)，脫氫醋酸鈉處理的各組雌性大鼠的飼料消耗明顯低于雄性大鼠。7 d 時(shí)，雌性大鼠的飼料消耗比正常對(duì)照組減少了19%～28%；雄性大鼠的飼料消耗比正常對(duì)照組減少了15%～21%。至13 d時(shí)，雌性大鼠的飼料消耗比正常對(duì)照組減少了69%～76%；雄性大鼠的飼料消耗比正常對(duì)照組減少了62%～71%。

2.2 脫氫醋酸鈉對(duì)大鼠PT、APTT的影響

2.2.1 對(duì)大鼠PT的影響 圖1為脫氫醋酸鈉處理后雄性及雌性大鼠的PT值。氫醋酸鈉處理5 d 后，所有時(shí)間點(diǎn)的PT值均極顯著高于正常對(duì)照組(P<0.01)。50 mg/kg～200 mg/kg間無(wú)明顯劑量效應(yīng)關(guān)系，雌性及雄性間PT值無(wú)明顯差別。

2.2.2 對(duì)大鼠APTT的影響 圖2為大鼠APTT測(cè)定數(shù)據(jù)。從圖2中可以看出，雄性或雌性大鼠服用脫氫醋酸鈉后各組APTT值與對(duì)照組比較極顯著延長(zhǎng)(P<0.01)。給予200 mg/kg脫氫醋酸鈉5 d～7 d時(shí)，雄性大鼠的APTT值高達(dá)200 s～300 s，遠(yuǎn)高于雌性大鼠的160 s～130 s。雌性大鼠在7 d～13 d間，APTT值隨劑量的增加而增加，有較明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系；100 mg/kg～200 mg/kg劑量組，APTT值隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加，表現(xiàn)出時(shí)間效應(yīng)關(guān)系；200 mg/kg 組13 d時(shí)超過(guò)200 s。而150 mg/kg和200 mg/kg雄性大鼠在第7天APTT出現(xiàn)峰值后，維持在相對(duì)穩(wěn)定的水平(150 s～170s)。

2.3 脫氫醋酸鈉致大鼠主要臟器出血情況

在給予脫氫醋酸鈉后第13天處死后剖檢大鼠，偶見(jiàn)皮下組織、肝臟和腎臟表面有出血點(diǎn)，未見(jiàn)明顯較多出血。其他組織無(wú)眼觀出血現(xiàn)象。

2.3.1 致大鼠肝臟出血 不同劑量脫氫醋酸鈉處理后，大鼠肝臟的病理切片見(jiàn)圖3。不同劑量脫氫醋酸鈉均可引起大鼠肝臟表現(xiàn)出不同程度的出血傾向，隨著脫氫醋酸鈉劑量的增加，出血程度有所加重，特別是D和E在肝小葉間隙可以看到明顯的出血點(diǎn)。

表1 脫氫醋酸鈉對(duì)大鼠體重的影響

注：角標(biāo)相同字母表示差異不顯著(P>0.05)；不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note：Values with same letters means no significant difference in the same column(P>0.05),and with different letters mean significant difference(P<0.05).

表2 脫氫醋酸鈉對(duì)大鼠飼料消耗的影響

注：角標(biāo)相同字母表示差異不顯著(P>0.05)；不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note：Values with same letters means no significant difference in the same column(P>0.05),and with different letters mean significant difference(P<0.05).

2.3.2 致大鼠脾臟、肺臟、腎臟和心臟出血 200 mg/kg脫氫醋酸鈉處理后，大鼠的脾臟、肺臟、腎臟和心臟病理切片見(jiàn)圖4。

由圖4可以看出，200 mg/kg組大鼠服用脫氫醋酸鈉后，心臟、脾臟、肺臟和腎臟有不同程度的出血現(xiàn)象，特別肺臟和腎臟出血較為明顯。可見(jiàn)肺組織中彌漫性出血，腎臟皮質(zhì)及髓質(zhì)均有不同程度的出血，腎小管附近出血更明顯。

3 討論

脫氫醋酸鈉作為防霉劑能夠延長(zhǎng)食品的儲(chǔ)存時(shí)間，但是過(guò)量添加會(huì)給動(dòng)物健康帶來(lái)潛在的危害。國(guó)內(nèi)外對(duì)脫氫醋酸及其鈉鹽作為添加劑使用，其使用范圍和使用量都有嚴(yán)格的規(guī)定。我國(guó)《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定，脫氫醋酸及其鈉鹽在黃油和濃縮黃油、腌漬的食用菌和藻類、發(fā)酵豆制品及果蔬汁(漿)中的最大使用量為0.3 g/kg；腌漬的蔬菜及淀粉制品的最大使用量為1.0 g/kg；在面包、糕點(diǎn)、焙烤食品餡料及表面用掛漿、預(yù)制肉制品、熟肉制品、復(fù)合調(diào)味料中的最大使用量為0.5 g/kg[14]。脫氫醋酸鈉對(duì)犬的毒性試驗(yàn)中，犬表現(xiàn)出食欲減退、體重減輕、嘔吐、抽搐、運(yùn)動(dòng)失調(diào)、腸道出血等臨床癥狀[15-16]。本試驗(yàn)中，隨著脫氫醋酸鈉劑量的增加，灌服時(shí)間的延長(zhǎng)，大鼠飼料消耗顯著減少、體重明顯降低，特別是150 mg/kg和200 mg/kg組差異極顯著，這與Sakaguchi Y等[8]的研究結(jié)果一致。

A.雄性；B.雌性

A.Male;B.Female

圖1不同劑量脫氫醋酸鈉對(duì)雌雄大鼠PT的影響

Fig.1 Effect of sodium dehydroacetate on the PT values of rats

A.雄性；B.雌性

A.Male;B.Female

圖2不同劑量的脫氫醋酸鈉對(duì)雌雄大鼠APTT的影響

Fig.2 Effect of sodium dehydroacetate on the APTT values of rats

A.正常對(duì)照組；B～E.50、100、150、200 mg/kg組;箭頭示出血

A.Normal control;B-E 50,100,150 and 200 mg/kg sodium dehydroacetate groups；Arrow indicates haemorrhage

圖3不同劑量脫氫醋酸鈉處理大鼠肝臟的病理變化(HE,200×)

Fig.3 Pathological lesions of liver in rats treated with different doses of sodium dehydroacetate(HE,200×)

B1～E1.正常對(duì)照組脾臟、腎臟、心臟和肺臟；b1～e1.200 mg/kg組脾臟、腎臟、心臟和肺臟;箭頭示出血

B1-E1.Spleen,kidney,heart and lung in normal rats;b1-e1.Spleen,kidney,heart and lung in 200mg/kg sodium dehydroacetate groups;Arrow indicates haemorrhage

圖4 200 mg/kg脫氫醋酸鈉致大鼠腎臟、脾臟、心臟和肺臟出血(HE,200×)

Fig.4 The haemorrhage in spleen,kidney,heart and lung of rats treated with 200 mg/kg sodium dehydroacetate(HE,200×)

PT和APTT是反映凝血功能的兩個(gè)基本指標(biāo)。PT和APTT延長(zhǎng)表明血液凝固出現(xiàn)障礙，有出血或出血傾向。大鼠給予不同劑量脫氫醋酸鈉后，PT值較正常對(duì)照組延長(zhǎng)了2倍～2.5倍，雌雄大鼠間無(wú)明顯差別。APTT值雄性大鼠5 d～7d 時(shí)延長(zhǎng)了3倍～22倍，7 d后延長(zhǎng)了5倍～12倍；雌性大鼠APTT值延長(zhǎng)了3倍～15倍。雌雄大鼠間APTT值有明顯差異。雌性大鼠的APTT值表現(xiàn)出隨劑量、時(shí)間的增加而延長(zhǎng)。從APTT這個(gè)指標(biāo)來(lái)看，雌性大鼠似乎對(duì)脫氫醋酸鈉的敏感性比雄性大鼠更高。但對(duì)器官的組織病理學(xué)并未觀察到雌性大鼠有更明顯的出血情況。高劑量時(shí)肝臟和肺臟的出血要比其他臟器明顯。

脫氫醋酸鈉較大劑量應(yīng)用，可引起大鼠凝血障礙，存在出血傾向。提示較大劑量脫氫醋酸鈉的應(yīng)用，可能存在著安全風(fēng)險(xiǎn)。作為在食品、飼料中應(yīng)用的防霉劑，此添加劑的用量在生產(chǎn)實(shí)際中不能隨意加大，應(yīng)限量使用。有關(guān)脫氫醋酸鈉應(yīng)用可能存在的出血現(xiàn)象及出血機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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