伊維菌素微乳的研制及質(zhì)量評價

朱慶賀，陳 曦，王麗坤，王 爽，駱宏偉，張 瑩，金振華，史同瑞

(黑龍江省獸醫(yī)科學(xué)研究所，黑龍江齊齊哈爾 161005)

藥物遞藥系統(tǒng)是醫(yī)藥界的熱點研究領(lǐng)域之一。微乳(microemulsion，ME)是一種新型遞藥系統(tǒng)，該系統(tǒng)是由表面活性劑、輔助表面活性劑、油和水以適當(dāng)?shù)谋壤榛傻囊环N均勻、低黏度、熱力學(xué)穩(wěn)定的透明或半透明分散體系[1-2]。微乳是由英國化學(xué)家Schulman等于1943年首先提出的。自20世紀(jì)70年代以來，人們對微乳的微觀結(jié)構(gòu)、形成理論、理化性質(zhì)進(jìn)行了較為深入的研究，并將微乳應(yīng)用于工業(yè)、日用化工業(yè)等領(lǐng)域。至20世紀(jì)90年代，人們又對微乳作為藥物的遞藥系統(tǒng)進(jìn)行了研究，并逐漸引起了人們的重視。雖然微乳與傳統(tǒng)乳狀液有著許多相似之處，但兩者之間也存在著本質(zhì)的區(qū)別。微乳是介于乳狀液和膠團(tuán)溶液之間的一種過度中間狀態(tài)溶液，是一種熱力學(xué)穩(wěn)定的體系，制備時不需要強(qiáng)大的外力，可以長期貯存，且離心不分層。微乳具有極高的穩(wěn)定性和對溶質(zhì)的高度分散性及吸附能力；微乳作為難溶性藥物的載體，具有加溶作用，使不溶或難溶性藥物的溶解度顯著升高，從而提高藥物的生物利用度及機(jī)體的吸收速率[3-4]。

伊維菌素(ivermectin，IVM)具有廣譜、高效、安全等優(yōu)點，是一種廣譜的抗寄生蟲藥物，對動物體內(nèi)外寄生蟲，尤其是線蟲和節(jié)肢動物，具有高效驅(qū)殺作用。由于伊維菌素幾乎不溶于水，因此，制約了伊維菌素的應(yīng)用范圍。目前，伊維菌素液體制劑主要有溶液劑、口服液、注射劑、乳劑、噴劑、透皮劑和澆潑劑等[5]。由于多數(shù)伊維菌素液體制劑均使用了大量的有機(jī)溶劑，且載藥量低，臨床用藥量大，因而常引起用藥部位發(fā)生炎癥和壞死，影響了該類藥物的使用效果。為克服現(xiàn)有弊端，本研究結(jié)合微乳制備技術(shù)，研究開發(fā)了50 mg/mL伊維菌素微乳劑，旨在方便伊維菌素的臨床使用，提高其應(yīng)用效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品 伊維菌素，含量97.0%，武漢益華成科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品；伊維菌素標(biāo)準(zhǔn)品，含量92.0%，中國食品藥品檢定研究院產(chǎn)品；蓖麻油，鄭州智遠(yuǎn)化工產(chǎn)品有限公司產(chǎn)品；肉豆蔻酸異丙酯，上海高維實業(yè)有限公司產(chǎn)品；丙二醇、正丁醇、正戊醇，油酸、司班-80、吐溫-80，天津市巴斯夫化工有限公司產(chǎn)品。

1.1.2 儀器 LC-20AT高效液相色譜儀，日本島津公司產(chǎn)品；Winner802納米粒度儀，濟(jì)南微納顆粒儀器股份有限公司產(chǎn)品；PXNDJ-2000型全自動運動黏度測定儀，上海軒澄儀器有限公司產(chǎn)品；ZNCL-S型恒溫磁力攪拌器，上海羌強(qiáng)儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品；WD-A藥物穩(wěn)定性檢查儀，天津藥典標(biāo)準(zhǔn)儀器廠產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 配方篩選與微乳劑制備 在單因素試驗基礎(chǔ)上，將篩選的表面活性劑、輔助表面活性劑按質(zhì)量比(Km)1∶2、1∶3、1∶4比例混合，配制成混合表面活性劑，再將篩選的油相分別與各配比的混合表面活性劑按質(zhì)量比1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1比例混勻。稱取約一定量的伊維菌素分別加入，混勻溶解，在室溫環(huán)境緩慢加入超純水，并不斷攪拌，觀察各配方體系的性狀變化，記錄體系由渾濁變至澄清時的臨界加水量。分別以油、表面活性劑和助表面活性劑作為三相，利用Origin 8.0繪制不同質(zhì)量比值的偽三元相圖，觀察乳區(qū)的大小，確定配方中最適Km值、微乳界限及乳劑配方[6-8]。

1.2.2 物理特性測定

1.2.2.1 性狀與pH 外觀檢查50 mg/mL伊維菌素微乳劑性狀，用精密pH計測定pH。

1.2.2.2 黏度與粒度測定 應(yīng)用全自動運動黏度計測定黏度。測試條件：溫度25 ℃，黏度系數(shù)1.20，同條件下測定3次，測得50 mg/mL伊維菌素微乳劑的運動黏度，該溫度下運動黏度和同溫度下液體密度之積為其動力黏度。應(yīng)用納米粒度儀，測定微乳劑粒徑大小及分布。

1.2.2.3 微乳類型鑒別 采用染色法[9]鑒別。取水溶性亞甲藍(lán)染液和油溶性蘇丹紅染液，分別滴入50 mg/mL伊維菌素微乳劑中，輕輕搖晃，觀察比較兩種染液顏色在微乳劑中的擴(kuò)散速度，判斷乳劑類型。

1.2.3 藥物含量檢測方法建立

1.2.3.1 色譜條件 流動相為甲醇∶乙腈∶水=40∶55∶5；流速1.0 mL/min；檢測波長244 nm；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量20 μL。

1.2.3.2 溶液配制 精密稱取伊維菌素標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，置于50 mL容量瓶中，加流動相溶解后定容至刻度，制成200 μg/mL的儲備溶液, 精密量取儲備液5.0 mL, 置10 mL容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，配置成100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)對照品溶液。

精密量取伊維菌素微乳相當(dāng)于伊維菌素10 mg，置于100 mL容量瓶中，加流動相定容至刻度，超聲30 min，搖勻，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，制成供試品溶液，進(jìn)樣測定。精密量取與供試品等量的空白乳劑，按照供試品溶液的制備方法制成陰性對照品溶液。

1.2.3.3 方法專屬性考察 取伊維菌素標(biāo)準(zhǔn)溶液、伊維菌素微乳供試品溶液、空白基質(zhì)溶液用流動相按一定比例稀釋后，分別進(jìn)樣20 μL，測定成分峰值，記錄色譜圖。

1.2.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精密量取對照品儲備液1.0、3.0、5.0、8.0、10 mL分別置10 mL容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，配置成濃度分別為20、60、100 、160 、200 μg/mL的系列對照品溶液。按1.2.3.1項下色譜條件測定，以峰面積(y)對利福昔明的濃度(x，μg/mL)進(jìn)行線性回歸方程。

1.2.3.5 穩(wěn)定性試驗 取濃度為100.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，避光保存，于0、2、4、6、8、12 h后進(jìn)樣20 μL，分別測定峰面積并代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計算實測濃度，并計算得其RSD。

1.2.3.6 回收率試驗 分別精密取適量儲備液并添加配方劑量的空白微乳，超聲溶解后用流動相稀釋成低(L=60 μg/mL )、中(M=100 μg/mL)、高(H=160 μg/mL)3種理論濃度的溶液，每個濃度配制3份，分別測定其含量，計算其回收率。

1.2.3.7 樣品含量測定 按照1.2.3.2項下供試品溶液制備方法處理樣品，制備供試品溶液，按上述色譜條件測定峰面積，按外標(biāo)法計算得樣品中伊維菌素的含量。

1.2.4 穩(wěn)定性評價

1.2.4.1 離心、滅菌、冷凍試驗 取50 mg/mL伊維菌素微乳劑，加入離心管中，以10 000 r/min轉(zhuǎn)速離心30 min；置高壓滅菌器內(nèi)，在121℃條件下高壓滅菌30 min；在-20 ℃環(huán)境貯存7 d～10 d，取出置室溫環(huán)境，分別觀察50 mg/mL伊維菌素微乳劑性狀。

1.2.4.2 光照試驗 取50 mg/mL伊維菌素微乳劑樣品3批，在光照度4 500 lx±500 lx條件下放置10 d，觀察微乳劑性狀，測定pH，以及黏度、粒度及伊維菌素含量。

1.2.4.3 加速試驗 取50 mg/mL伊維菌素微乳劑樣品3批，置溫度40℃±2℃環(huán)境中放置6個月，每月取樣，觀察微乳劑性狀，測定伊維菌素含量。

1.2.4.4 長期試驗 取50 mg/mL伊維菌素微乳劑樣品3批，置室溫環(huán)境中放置24個月，分別在0、3、6、9、12、18、24個月取樣檢測，觀察微乳劑性狀，測定伊維菌素含量。

2 結(jié)果

2.1 配方篩選結(jié)果

根據(jù)偽三元相圖篩選結(jié)果，當(dāng)表面活性劑與輔助表面活性劑的質(zhì)量比為1∶4時，形成的微乳乳區(qū)面積最大，因此，選擇微乳區(qū)大、穩(wěn)定性好的各組分配比作為微乳劑配方(圖1)。篩選的50 mg/mL伊維菌素微乳劑各組分配比為伊維菌素5%、油6.79%、乳化劑13.58%、輔助乳化劑54.27%、超純水20.36%。

圖1 不同乳劑體系的偽三元相圖

2.2 乳劑物理特性

外觀50 mg/mL伊維菌素微乳劑為淡黃色、油狀透明液體，微乳劑pH為6.27～6.32，運動黏度為610.50 mm2/s，動力黏度為714.28 mPa·s，乳滴粒徑主要分布在1 nm～10 nm范圍內(nèi)，平均粒徑為6.30 nm(圖2)。微乳劑類型鑒別結(jié)果表明，水溶性亞甲藍(lán)染液擴(kuò)散速度較快，由此判定50 mg/mL伊維菌素微乳劑為O/W型乳劑。

2.3 伊維菌素含量檢測方法

2.3.1 方法專屬性考察 分別測定伊維菌素標(biāo)準(zhǔn)溶液、伊維菌素微乳供試品溶液、空白基質(zhì)溶液的峰面積。如圖3所示，供試品溶液和標(biāo)準(zhǔn)溶液保留時間一致，約5.3 min，組方中的輔料在此時無吸收，所以不干擾伊維菌素含量的測定。

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 依據(jù)試驗結(jié)果，得回歸方程y=33 962x+26 173，R2=0.999。試驗表明，伊維菌素濃度在20.0 μg/mL～200.0 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

圖2 50 mg/mL伊維菌素微乳劑粒徑分布曲線圖

2.3.3 穩(wěn)定性試驗 分別測定0、2、4、6、8、12 h標(biāo)準(zhǔn)品溶液峰面積并代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計算實測濃度，得其RSD=1.3%(表1)。

2.3.4 回收率試驗 分別測定高、中、低三種濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液含量，計算得其平均回收率為98.37%～101.70%(表2)。

圖3 伊維菌素HPLC色譜圖

2.4 微乳劑穩(wěn)定性

50 mg/mL伊維菌素微乳劑經(jīng)10 000 r/min離心30 min，未見分層、析出等異?，F(xiàn)象。在121℃高壓滅菌30 min及冷凍保存后，外觀性狀均未見異常變化。光照試驗結(jié)果表明，微乳劑在光照度4 500 lx±500 lx條件下放置10 d，其pH、平均粒徑、運動黏度、動力黏度、藥物含量均未見明顯變化(表3)。加速試驗和長期試驗結(jié)果表明，微乳劑外觀性狀均未見變化，藥物含量均在正常范圍內(nèi)，符合藥物質(zhì)量規(guī)定(表4和表5)。

表1 穩(wěn)定性試驗結(jié)果

表2 回收率試驗結(jié)果

表3 伊維菌素微乳劑光照試驗結(jié)果

表4 加速試驗中伊維菌素的含量測定結(jié)果

表5 長期試驗中伊維菌素的含量測定結(jié)果

3 討論

在制備微乳劑時，確定油相和乳化劑的種類及配比是決定乳劑穩(wěn)定性的關(guān)鍵因素。本試驗首先依據(jù)伊維菌素在不同油相中的溶解度，選擇溶解度高的油相作為初選油相，然后依據(jù)親水親油平衡值(HLB)，選擇表面活性劑。根據(jù)油相對制備O/W型微乳所需的HLB值，以及O/W型微乳需用HLB值為8～18范圍的表面活性劑，篩選適宜的表面活性劑和輔助表面活性劑。在確定了表面活性劑、輔助表面活性劑和油相后，通過相圖選擇較大微乳區(qū)的各組分配比，并確定微乳劑配方。試驗證實，本試驗篩選配方制備的微乳劑性狀穩(wěn)定。

在確定合適的微乳配方后，微乳的制備工藝較為簡單。在制備伊維菌素微乳劑時，環(huán)境溫度、攪拌速度和時間對微乳劑制備的影響均不明顯，這與丁丹等[10]報道結(jié)果一致。筆者認(rèn)為，制備穩(wěn)定微乳的關(guān)鍵是篩選適宜的配方，除此之外，原材料的質(zhì)量，以及各組分加入后攪拌的均勻度與乳劑質(zhì)量具有明顯關(guān)聯(lián)性。本制備試驗表明，如果原材料質(zhì)量較差，或者攪拌不均勻，雖然在制備空白乳劑時也能形成微乳，但微乳對藥物的溶解性降低，微乳劑經(jīng)高壓滅菌后出現(xiàn)分層，但搖勻后也能恢復(fù)原狀。

粒徑是衡量微乳形成與否的標(biāo)準(zhǔn)，粒徑分布是評價微乳穩(wěn)定性的重要指標(biāo)。經(jīng)納米粒度儀測定，本試驗制備的微乳劑平均粒徑為6.30 nm，符合微乳粒徑均在100 nm以下范圍。微乳的顯著增溶效果與其高分散性有關(guān)，O/W型微乳劑可有效提高藥物的溶解度[11-12]。本試驗證實，與常規(guī)10 mg/mL伊維菌素注射液制備工藝比較，微乳劑不僅可明顯提高伊維菌素的溶解度，而且還簡化了生產(chǎn)工藝，降低了生產(chǎn)成本。本研究采用HPLC法測定伊維菌素含量，直接用流動稀釋、定容，用0.45 μm微孔濾膜過濾后進(jìn)樣，結(jié)果表明，微乳劑中其他輔料對伊維菌素的測定無干擾，試驗說明，該方法簡便易行，靈敏度高，重現(xiàn)性好。

目前，劉根新等[13]制備了50 mg/mL伊維菌素O/W型納米乳注射液，湯佳莘等[14]研制了含0.3 mg/mL伊維菌素和50 mg/mL吡喹酮復(fù)方納米乳，丁丹等[10]研制了20 mg/mL伊維菌素O/W型納米乳透皮劑。蘭州畜牧與獸藥研究所研制了含水80%的伊維菌素微乳[15]。本試驗研制的50 mg/mL伊維菌素微乳劑含水量為20.36%，雖然提高含水量也可制備同濃度的伊維菌素乳劑或亞微乳劑，但外觀呈半透明狀態(tài)，總體質(zhì)量評價劣于含水20.36%的微乳劑，因此，篩選確定了本試驗配方，且該配方制備工藝簡便，質(zhì)量優(yōu)良，易于實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。

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