魚源嗜水氣單胞菌和維氏氣單胞菌PCR-RFLP鑒別方法的建立

郭 睿

(福州市海洋與漁業(yè)技術(shù)中心,福建福州 350026)

氣單胞菌(Aeromonasspp.)是一種遍布水環(huán)境的革蘭陰性桿菌，是水生動(dòng)物和包括人在內(nèi)的多種陸生動(dòng)物的條件致病菌，屬于氣單胞菌科(Aeromonadaceae)，目前已明確鑒定到種的有26種[1-2]。大體分為兩類：一類是不具運(yùn)動(dòng)性的嗜冷氣單胞菌，以殺鮭氣單胞菌(A.salmonicida)為代表；另一類是具運(yùn)動(dòng)性的嗜溫氣單胞菌，包括常見的嗜水氣單胞菌(A.hydrophila)、維氏氣單胞菌(A.veronii)等[3]，其中一部分是運(yùn)動(dòng)性氣單胞菌敗血癥(MotileAeromonassepticemia，MAS)的主要病原，嚴(yán)重危害淡水魚養(yǎng)殖[4]。這些細(xì)菌一般是條件致病菌，魚類感染后會(huì)出現(xiàn)非特定體征，如鰭條腐爛、潰瘍、出血、凸眼、水腫等[5]。

在氣單胞菌的鑒定上，采用傳統(tǒng)的細(xì)菌形態(tài)分類和生理生化鑒定費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且對(duì)血清型復(fù)雜、生化特征不穩(wěn)定的病原菌容易發(fā)生誤判[6]，而使用分子生物學(xué)方法，具有快速、準(zhǔn)確、靈敏度較高等優(yōu)點(diǎn)，其中在基因序列分析基礎(chǔ)上發(fā)展的聚合酶鏈反應(yīng)-限制性(核酸內(nèi)切酶酶切)片段長度多態(tài)性(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP)分子標(biāo)記技術(shù)具有較好的應(yīng)用前景，選取常規(guī)和應(yīng)用廣泛的16 S rDNA基因，進(jìn)行PCR-RFLP分析，在種水平鑒定氣單胞菌是一種快速和有效的方法[7-10]，已有較多研究應(yīng)用16 S rDNA PCR-RFLP對(duì)氣單胞菌進(jìn)行鑒定，其中大部分是醫(yī)學(xué)臨床菌株，在內(nèi)切酶的選擇上大多使用AluⅠ和MboⅠ進(jìn)行雙酶切[5,10-14]，但這一雙酶切是為了對(duì)當(dāng)時(shí)所有氣單胞菌種進(jìn)行分類鑒定，使得每一種菌對(duì)應(yīng)一種RFLP帶型[7-8]，其帶型較為復(fù)雜，對(duì)于臨床和水產(chǎn)上常見的致病菌針對(duì)性不強(qiáng)[9]，有時(shí)為提高電泳分辨率還要用到聚丙烯酰胺凝膠電泳[5,13]，不適用于快速鑒定。對(duì)于水產(chǎn)魚源常見氣單胞菌有必要選擇針對(duì)性較強(qiáng)的內(nèi)切酶開展16 S rDNA PCR-RFLP，以達(dá)到快速鑒別菌種的目的。

本文選取福建地區(qū)養(yǎng)殖場(chǎng)分離的12株魚源致病氣單胞菌，通過對(duì)16 S rDNA序列的分析，結(jié)合GenBank中相關(guān)致病菌株的序列，篩選出鑒別嗜水氣單胞菌和維氏氣單胞菌的限制性核酸內(nèi)切酶，用PCR-RFLP分子標(biāo)記的方法對(duì)這2種氣單胞菌的鑒別，可用于對(duì)于水產(chǎn)魚類嗜水氣單胞菌和維氏氣單胞菌病害的快速鑒別檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 試驗(yàn)用12株魚源致病氣單胞菌，包括嗜水氣單胞菌5株，維氏氣單胞菌6株，溫和氣單胞菌(A.sobria)1株，其中1株嗜水氣單胞菌(CHS-3)和2株維氏氣單胞菌(AH13-3，HB-2)由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所饋贈(zèng)，1株嗜水氣單胞菌(JS)由福建省淡水水產(chǎn)研究所饋贈(zèng)，其余8株由筆者所在福州市水生動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心鑒定保種(表1)。

表1 12株氣單胞菌菌株來源

1.1.2 主要試劑 營養(yǎng)肉湯(NB)培養(yǎng)基，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司產(chǎn)品；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，北京百泰克生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；2 ×TaqPCR Master Mix、DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000，天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品；瓊脂糖，英國OXOID公司產(chǎn)品；限制性核酸內(nèi)切酶SnaBⅠ、BseNⅠ、NruⅠ，美國Fermentas-Thermo Scientific公司產(chǎn)品。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 16 S rDNA序列測(cè)定與系統(tǒng)發(fā)育分析

1.2.1.1 PCR模板的制備 將純化培養(yǎng)后的菌株無菌挑取單克隆于NB中培養(yǎng)24 h，取2 mL菌液10 000 r/min離心30 s；收集菌體，按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA，作為PCR模板，置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.2 16 S rDNA基因序列的擴(kuò)增與測(cè)序 細(xì)菌16 S rDNA通用引物，27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)，退火溫度50℃，目的片段大小約1 500 bp。PCR反應(yīng)體系(50 μL)包括：2 ×TaqPCR Master Mix 25 μL，25 mmol/L的引物各1 μL，模板DNA 1 μL，用超純水調(diào)整終體積至50 μL。反應(yīng)結(jié)束后按常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳方法進(jìn)行檢測(cè)。PCR產(chǎn)物經(jīng)ABI 3730 DNA 測(cè)序儀測(cè)序后，用Mega 5.2對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行校正。

1.2.1.3 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 將菌株的16 S rDNA基因序列與GenBank中已公布的核酸序列進(jìn)行在線Blast分析(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)，調(diào)出與該序列同源性較高的核酸序列，并參照LPSN(http://www.bacterio.cict.fr/a/aeromonas.html)下載氣單胞菌屬的部分相關(guān)模式菌株的16 S rDNA基因序列及同種不同株系的16 S rDNA基因序列。將上述序列使用Mega 5.2完成序列比對(duì)后，以大腸埃希菌(Escherichiacoli)和霍亂弧菌(Vibriocholerae)為外群，采用臨接近法(Neighbor-Joining method，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，通過自舉分析(Bootstrap)進(jìn)行置信度檢測(cè)，自舉次數(shù)1 000次，以估算其內(nèi)分支的支持率。

1.2.2 限制性片段長度多態(tài)性分析

1.2.2.1 序列分析和限制性內(nèi)切酶的篩選 采用DNA Man Version 6對(duì)嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌和維氏氣單胞菌的16 S rDNA的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，并結(jié)合GenBank中相關(guān)菌株的序列，應(yīng)用引物設(shè)計(jì)軟件Primer 5.0查找序列中的可用酶切位點(diǎn)并篩選其中高度穩(wěn)定的位點(diǎn)，使用在線Fast Digest Enzyme Selection Tool選取合適的限制性核酸內(nèi)切酶。

1.2.2.2 PCR制備酶切底物和16 S rDNA-RFLP分析 PCR體系和參數(shù)同上，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，將檢測(cè)良好的產(chǎn)物用于后續(xù)酶切試驗(yàn)。依據(jù)限制性核酸內(nèi)切酶的說明書，在冰上配制酶切反應(yīng)體系(15 μL)，每管反應(yīng)體系加入PCR產(chǎn)物5 μL進(jìn)行酶切，反應(yīng)參數(shù)按照說明書分別設(shè)置。酶切結(jié)束后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電泳后使用凝膠成像系統(tǒng)顯現(xiàn)目的條帶，對(duì)3種氣單胞菌的酶切電泳圖譜進(jìn)行PCR-RFLP分析。

2 結(jié)果

2.1 序列分析與系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

12個(gè)菌株的16 S rDNA基因測(cè)序結(jié)果經(jīng)校正后獲得約1 500 bp，其中嗜水氣單胞菌的序列(GenBank登錄號(hào)為KC812104、KC812105、KC812106、KF483980、KF483982)和維氏氣單胞菌的序列(GenBank登錄號(hào)為KC633849、KY767546、KY767547、KY767548、KY767550、KY767551)，分別與GenBank中多株嗜水氣單胞菌和維氏氣單胞菌的16 S rDNA基因序列高度同源，同源性達(dá)到99%以上；作為參考的溫和氣單胞菌序列(GenBank登錄號(hào)為KY767549)與GenBank中溫和氣單胞菌的16S rDNA基因序列高度同源，同源性達(dá)到99%以上(圖1)。

采用NJ法基于16 S rDNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹，本試驗(yàn)的5株嗜水氣單胞菌、6株維氏氣單胞菌和1株溫和氣單胞菌分別與已報(bào)道的同一種氣單胞菌聚為一大支，其中嗜水氣單胞菌和豚鼠氣單胞菌(A.caviae)構(gòu)成姊妹群，維氏氣單胞菌與簡達(dá)氣單胞菌(A.jandaei)構(gòu)成姊妹群，殺鮭氣單胞菌和獸生氣單胞菌(A.bestiarum)依據(jù)16 S rDNA序列不能區(qū)分，二者一起與溫和氣單胞菌構(gòu)成姊妹群(圖1)。

圖1 12株氣單胞菌與同屬相關(guān)種之間基于16 S rDNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 限制性核酸內(nèi)切酶的選擇及PCR-RFLP分析

經(jīng)比對(duì)，發(fā)現(xiàn)所擴(kuò)增的3種氣單胞菌的16 S rDNA基因序列同源性為99.1%。依據(jù)16 S rDNA基因的種間序列差異，選取限制性核酸內(nèi)切酶SnaBⅠ，酶切位點(diǎn)為TAC↓GTA，可酶切嗜水氣單胞菌中的特異序列；選取限制性核酸內(nèi)切酶BseNⅠ，酶切位點(diǎn)為ACTGGN↓，可酶切3種氣單胞菌中的差異序列；選取限制性核酸內(nèi)切酶NruⅠ，酶切位點(diǎn)為TCG↓CGA，可酶切溫和氣單胞菌中的特異序列。對(duì)經(jīng)電泳驗(yàn)證的重新擴(kuò)增的16 S rDNA PCR酶切底物使用PCR儀進(jìn)行酶切試驗(yàn)，反應(yīng)體系按照說明書，反應(yīng)參數(shù)依次設(shè)置為SnaBⅠ37 ℃ 5 min；BseNⅠ65 ℃ 5 min；NruⅠ37 ℃ 5 min。酶切結(jié)束后上樣電泳，PCR-RFLP結(jié)果見圖2。

A.SnaBⅠ；B.BseNⅠ；C.NruⅠ

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;0.對(duì)照；1～5.為嗜水氣單胞菌；6.溫和氣單胞菌；7～12維氏氣單胞菌

M.DNA Marker DL 2 000;0.Control；1-5.A.hydrophila；6.A.sobria；7-12.A.veronii

圖2 12株氣單胞菌16 S rDNA PCR-RFLP酶切電泳

Fig.2 Electrophoretic patterns of 16 S rDNA PCR-RFLP analysis of twelve aeromonads

用SnaBⅠ可以將嗜水氣單胞菌的16 S rDNA酶切為1 000 bp和500 bp的2條條帶，但對(duì)溫和氣單胞菌和維氏氣單胞菌沒有作用(圖2A)；用BseNⅠ可以將氣單胞菌的16 S rDNA酶切為900、250、250 bp以下的短帶，其中嗜水氣單胞菌和溫和氣單胞菌的帶型一樣，二者250 bp以下短帶較易區(qū)分，而維氏氣單胞菌的短帶大小相近，據(jù)此可鑒別維氏氣單胞菌(圖2B)；用NruⅠ可以將溫和氣單胞菌的16 S rDNA酶切為1 250 bp和250 bp的2條條帶，但對(duì)嗜水氣單胞菌和維氏氣單胞菌沒有作用(圖2C)。

3 討論

嗜水氣單胞菌是引起魚類暴發(fā)性疾病的一種重要條件致病菌，致病范圍廣，可導(dǎo)致鯉(Cyprinuscarpio)、青魚(Mylopharyngodonpiceus)、草魚(Ctenopharyngodonidellus)、鰱(Hypophthalmichthysmolitrix)、鳙(Aristichthysnobilis)、黃鱔(Monopterusalbus)、西伯利亞鱘(Acipenserbaeri)、歐洲鰻鱺(Anguillaanguilla)等多種魚類患細(xì)菌性敗血癥。維氏氣單胞菌又稱維羅納氣單胞菌，有報(bào)道稱與小魚氣單胞菌(A.ichthiosmia)為同一物種[15]，可導(dǎo)致羅非魚(Oreochromissp.)、西伯利亞鱘(Acipenserbaeri)、泥鰍(Misgurnusanguillicaudatus)、歐洲鰻鱺(Anguillaanguilla)等魚類致病，此外在孔雀魚(Poecilliareticulata)、錦鯉(Cyprinuscarpio(koi))、吻鱸(Helostomatemminckii)、泰國搏魚(Bettasplendens)等患有敗血癥的觀賞魚臟器中也有檢出維氏氣單胞菌[5]。這2種氣單胞菌對(duì)淡水魚類危害較大，若使用常規(guī)方法難以在種水平鑒別，有必要使用分子生物學(xué)手段開發(fā)一種快速鑒別的方法。

限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)是分子標(biāo)記的一種，當(dāng)前使用較多的是基于聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的PCR-RFLP，其酶切底物是PCR擴(kuò)增的目的片段，可以在種水平快速和有效鑒定氣單胞菌[7-10]。Borrell N等[7]于1997年最初使用16 S rDNA PCR-RFLP技術(shù)對(duì)當(dāng)時(shí)的所有15種氣單胞菌進(jìn)行分類鑒定，其中11種可以使用AluⅠ和MboⅠ進(jìn)行雙酶切，依據(jù)差異帶型同時(shí)鑒別，其余相同帶型的4種可以結(jié)合其他限制酶鑒定。近年來，對(duì)氣單胞菌使用PCR-RFLP進(jìn)行鑒定的報(bào)道也大多使用AluⅠ和MboⅠ進(jìn)行雙酶切[5,10-14]，這一雙酶切組合產(chǎn)生的RFLP帶型中條帶多而復(fù)雜，主要差異條帶集中在207 bp以下且長度差異不大，會(huì)出現(xiàn)非典型的RFLP帶型，用瓊脂糖凝膠電泳分辨率不高而且需要電泳較長時(shí)間，其中的小片段不易識(shí)別，有研究者為提高分辨率用聚丙烯酰胺凝膠電泳[5,13]，加大了工作量和延長了鑒定時(shí)間。

本研究對(duì)福建地區(qū)12株魚源致病氣單胞菌在采用傳統(tǒng)分子生物學(xué)細(xì)菌鑒別方法的基礎(chǔ)上(即對(duì)16 S rDNA擴(kuò)增、測(cè)序和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹鑒定菌種)，避開序列中種內(nèi)差異位點(diǎn)并選擇穩(wěn)定的種間差異位點(diǎn)，篩選出嗜水氣單胞菌16 S rDNA的特異性限制性核酸內(nèi)切酶SnaBⅠ和可以快速鑒別維氏氣單胞菌的限制性核酸內(nèi)切酶BseNⅠ，同時(shí)篩選出鑒別溫和氣單胞菌的限制性核酸內(nèi)切酶NruⅠ，以上內(nèi)切酶產(chǎn)生的RFLP帶型較為明顯，酶切后可鑒別菌種的可辨條帶在4條以內(nèi)，酶切試驗(yàn)和常規(guī)的瓊脂糖凝膠電泳可以在1 h內(nèi)完成。結(jié)合GenBank中相關(guān)致病氣單胞菌的16 S rDNA序列，SnaBⅠ可以特異鑒定嗜水氣單胞菌；BseNⅠ對(duì)嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌、維氏氣單胞菌和簡達(dá)氣單胞菌都可酶切產(chǎn)生RFLP帶型，理論上豚鼠氣單胞菌和嗜水氣單胞菌以及溫和氣單胞菌酶切帶型一致，可以結(jié)合SnaBⅠ以鑒別嗜水氣單胞菌和溫和氣單胞菌，而豚鼠氣單胞菌需要補(bǔ)充發(fā)酵葡萄糖是否產(chǎn)氣等試驗(yàn)來鑒別，維氏氣單胞菌和簡達(dá)氣單胞菌酶切帶型一致，可以通過維氏氣單胞菌利用蔗糖，而簡達(dá)氣單胞菌不利用蔗糖來鑒別；NruⅠ除了酶切溫和氣單胞菌外，還可酶切殺鮭氣單胞菌和與其僅有2堿基序列差異的獸生氣單胞菌[16]，但理論上酶切殺鮭氣單胞菌和獸生氣單胞菌會(huì)產(chǎn)生3個(gè)條帶，不同于溫和氣單胞菌的2個(gè)條帶(圖2C)，由于本研究溫和氣單胞菌僅有1株，考慮到種內(nèi)不同株系可能存在差異或異質(zhì)性而沒有深入試驗(yàn)，但若結(jié)合GenBank中報(bào)道的溫和氣單胞菌相關(guān)序列，該種間差異位點(diǎn)相對(duì)保守，限制性核酸內(nèi)切酶NruⅠ具有一定的開發(fā)潛力。本研究所建立方法與傳統(tǒng)理化鑒別方法相比，減少了病原菌的誤判和大量繁重耗時(shí)的培養(yǎng)鑒別工作[6]；與常規(guī)分子生物學(xué)檢測(cè)方法相比，可以避免每次對(duì)同一菌種鑒定時(shí)的重復(fù)測(cè)序和后續(xù)的序列比對(duì)、分析。

本研究用16 S rDNA PCR-RFLP的分子標(biāo)記方法對(duì)福建地區(qū)的2種魚源致病氣單胞菌進(jìn)行了分子鑒定，篩選出嗜水氣單胞菌16 S rDNA的特異性限制性核酸內(nèi)切酶SnaBⅠ和可以較為快速鑒別維氏氣單胞菌的限制性核酸內(nèi)切酶BseNⅠ，對(duì)于這2種魚源常見氣單胞菌的鑒定時(shí)間較當(dāng)前基于測(cè)序構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹以鑒定氣單胞菌所用時(shí)間大大縮短，其中PCR后酶切和常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳可以在1 h內(nèi)完成。本研究對(duì)于水產(chǎn)魚類嗜水氣單胞菌和維氏氣單胞菌病害的快速鑒別具有參考和應(yīng)用價(jià)值。

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