石莼多糖及其脫蛋白與降解產(chǎn)物的相關(guān)性能

許雅楠, 呂 峰, 李燕妹, 林麗云, 傅麗娟

(福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002)

眾多研究表明，海藻多糖具有保濕、抗病毒、抗氧化、降血脂、抗腫瘤等多種生理活性，適當(dāng)?shù)母男曰蛐揎椏梢燥@著影響其相關(guān)理化性質(zhì)與生理活性[1].天然多糖物質(zhì)，尤其是海藻多糖，糖鏈上存在大量親水性基團(tuán)，如羥基、羧基，能與水分子相互交聯(lián)形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[2]，具有優(yōu)異的吸濕、保濕性能.此外，天然多糖物質(zhì)通常還具有抗菌、抗氧化等多重功效，并兼具低過敏性與安全性，是具有極大開發(fā)潛力的新型天然保濕材料.

本研究測定、對(duì)比了石莼多糖及其脫蛋白與降解產(chǎn)物的硫酸根含量、吸濕保濕性與體外抗氧化活性，探究脫蛋白與降解處理對(duì)石莼多糖相關(guān)性能的影響，旨在為深入開展石莼多糖及其改性與深加工研究，開發(fā)以石莼多糖為原料的具保濕、抗氧化活性的食品、化妝品等提供科學(xué)參考依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

石莼干粉：過80目篩，購于福建海興保健食品有限公司.

主要試劑：二苯代苦味酰自由基(DPPH·)，購于TCI公司；2，2′-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)，購于Solarbio公司.無水乙醇、過氧化氫、硫酸亞鐵、水楊酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、三羥甲基氨基甲烷、鄰苯三酚、鹽酸、抗壞血酸、冰酸酸、醋酸鈉、海藻酸鈉、殼聚糖等，均為國產(chǎn)分析純.

主要儀器設(shè)備：DL-5-B離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)、UV-1800PC紫外可見光分光光度計(jì)(上海美譜達(dá)儀器有限公司)、JB-90-2磁力攪拌器(上海天平儀器廠)、Starter 3C型pH計(jì)[奧豪斯儀器(上海)有限公司].

在文章后面的描述中，為了表達(dá)的簡練性，石莼多糖粗品(crudeUlvapolysaccharide)，簡稱CUP；石莼脫蛋白多糖(deproteinatedUlvapolysaccaride)，簡稱DUP；石莼多糖粗品降解產(chǎn)物(degradation product of crudeUlvapolysaccharide)，簡稱DCUP.

1.2 方法

1.2.1 CUP、DUP及DCUP樣品的制備 CUP樣品的制備：稱取一定質(zhì)量的石莼干粉，加入30倍質(zhì)量的蒸餾水，調(diào)節(jié)溶液pH值為4.8；按400 U·g-1石莼干粉添加經(jīng)活化的纖維素酶，于45 ℃下恒溫提取90 min，滅酶，離心，收集上清液，真空濃縮；加入4倍體積的95%乙醇，冷藏過夜，離心，收集乙醇沉淀物，加水復(fù)溶，真空濃縮，冷凍干燥，得CUP樣品(多糖含量35.62%).

DUP樣品的制備：稱取一定質(zhì)量的CUP樣品復(fù)溶，控制其蛋白濃度為0.70%，調(diào)節(jié)溶液pH值為10.5；按1 050 U·g-1CUP的量加入活化的堿性蛋白酶，于55 ℃下恒溫酶解2 h，滅酶，離心，收集上清液，于7 000 Da透析袋中流水透析48 h，真空濃縮，冷凍干燥，得DUP樣品(多糖含量66.97%).

DCUP樣品的制備：稱取CUP樣品溶于預(yù)熱至90 ℃的0.3 mol·L-1硫酸溶液，調(diào)整多糖濃度為0.70%，于90 ℃下恒溫反應(yīng)1 h，冰浴冷卻，離心，收集上清液，調(diào)節(jié)溶液pH至中性，于500 Da透析袋中流水透析48 h，真空濃縮，冷凍干燥，得降解率為(50±1)%的DCUP樣品(多糖含量34.41%).其中，降解率(還原糖相對(duì)含量)，計(jì)算公式如下(1)：

(1)

式中，C為待測樣液的總糖含量；C0為待測樣液的還原糖初始含量；C1為待測樣液降解后的還原糖含量.

1.2.2 CUP、DUP及DCUP的硫酸根含量的測定 (1)硫酸根標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:采用明膠—氯化鋇分光光度法繪制硫酸根標(biāo)準(zhǔn)曲線[3-4]，以0.5%氯化鋇—明膠溶液為試驗(yàn)對(duì)象，氯化鋇—明膠溶液為空白對(duì)照，二者360 nm處光密度分別為D2、D1，以D1、D2差值(Y)對(duì)硫酸根含量(X)作硫酸基標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算求得回歸方程：

Y=0.660 6X-0.001 5(R2=0.992 2)

(2)

(2)樣品硫酸根含量測定:稱取一定量樣品，以1 mol·L-1鹽酸溶解并配制成1 mg·mL-1樣品溶液，100 ℃水浴6 h.反應(yīng)完畢后，吸取樣品鹽酸溶液0.2 mL，分別加入3.8 mL 3%三氯乙酸、1.0 mL氯化鋇—明膠(試驗(yàn)組)或1.0 mL 0.5%明膠溶液(空白組)，其余操作同(1).

1.2.3 CUP、DUP及DCUP吸濕性、保濕性的測定 (1)吸濕性測定:將飽和硫酸銨溶液置于密閉干燥器的底部，使其形成相對(duì)濕度為80%的恒濕環(huán)境，放入50 ℃干燥至恒重的CUP、DUP、DCUP及甘油、殼聚糖、海藻酸鈉對(duì)照樣各1.0 g，在室溫條件下，于第3、6、9、12、24 h分別稱其質(zhì)量，計(jì)算、測定各待測樣品的吸濕率.試驗(yàn)平行重復(fù)3次，取平均值.

(3)

式中：M1為試驗(yàn)前待測樣品的質(zhì)量(g)；M2為試驗(yàn)后待測樣品的質(zhì)量(g).

(2)保濕性測定:取50 ℃干燥至恒重的CUP、DUP、DCUP及甘油、殼聚糖、海藻酸鈉對(duì)照樣各1.0 g，加入3倍于其質(zhì)量的蒸餾水，使其充分吸水、溶脹后，放入相對(duì)濕度為30%的密閉硅膠—干燥器，在室溫條件下，于3、6、9、12、24、36、48 h分別稱其質(zhì)量，計(jì)算、測定各待測樣品的保濕率.平行重復(fù)3次，取其平均值.

(4)

式中：N1為試驗(yàn)前待測樣品的水分質(zhì)量(g)；N2為試驗(yàn)后待測樣品的水分質(zhì)量(g).

(3)最松松密度的測定:參考周潔英[5]的方法，將CUP、DUP、DCUP樣品粉末通過漏斗小孔裝滿量杯，刮平，稱重，計(jì)算其密度.

(5)

式中：M為待測樣品粉體重量(g)；V為量杯體積(cm3).

1.2.4 CUP、DUP及DCUP的體外抗氧化活性的測定 (1)DPPH·清除力的測定:參考周先麗[6]的方法，以0.1 mg·mL-1VC溶液為陽性對(duì)照，平行重復(fù)3次，結(jié)果取平均值.待測樣液對(duì)DPPH·的清除率的計(jì)算公式如下：

(6)

式中，Di為體系于暗處反應(yīng)30 min后在517 nm處的光密度；D0為蒸餾水代替待測樣液加入反應(yīng)體系時(shí)的光密度；Dj為乙醇溶液代替DPPH·醇溶液加入反應(yīng)體系時(shí)的光密度.

(2)總抗氧化能力的測定(對(duì)ABTS+·的清除率):參考鄭淋[7]、OZGEN[8]的方法，稍作調(diào)整：取1.0 mL樣品溶液加入3.0 mL ABTS+·工作液，靜置30 min后于734 nm測定體系光密度.以0.1 mg·mL-1VC溶液為陽性對(duì)照，平行重復(fù)3次，結(jié)果取平均值.待測樣液對(duì)ABTS+·的清除率的計(jì)算公式如下：

(7)

式中，Di為反應(yīng)體系反應(yīng)30 min后在734 nm處的光密度；D0為蒸餾水代替待測樣液加入反應(yīng)體系時(shí)的光密度；Dj為醋酸緩沖溶液代替ABTS+·工作液加入反應(yīng)體系時(shí)的光密度.

(3)·OH清除力的測定:采用水楊酸法[9].以0.4 mg·mL-1VC溶液作為陽性對(duì)照，平行重復(fù)3次，結(jié)果取平均值.待測樣液對(duì)·OH清除率的計(jì)算公式如下：

(8)

式中，Di為體系反應(yīng)30 min后在510 nm處的光密度；D0為蒸餾水代替待測樣液加入反應(yīng)體系中作為空白對(duì)照時(shí)的光密度；Dj為以1.0 mL蒸餾水代替過氧化氫溶液加入到反應(yīng)體系中時(shí)的光密度.

(9)

式中，v1為待測樣液鄰苯三酚體系自氧化速率；v2為蒸餾水代替待測樣液加入反應(yīng)體系中的自氧化速率.

(5)對(duì)鐵氰化鉀還原力的測定(FRAP):參考APAK[10]的方法測定反應(yīng)體系的光密度.以0.1 mg·mL-1VC溶液作為陽性對(duì)照，平行重復(fù)3次，結(jié)果取其平均值.

1.2.5 統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用DPS v7.05進(jìn)行方差分析，各數(shù)據(jù)間多重比較采用Duncan新復(fù)極差法，Microsoft Excel 2007軟件繪圖.顯著性界值以P>0.05為不顯著，P<0.05為顯著，P<0.01為極顯著.

2 結(jié)果與分析

2.1 CUP、DUP及DCUP硫酸根含量

經(jīng)測定，CUP的硫酸根含量為(25.32±0.77)%，極顯著高于DUP(12.71±0.26)%(P<0.01)；但與DCUP(24.22±0.46)%的差別不顯著(P>0.05).可能是由于本試驗(yàn)采用的CUP樣品經(jīng)堿性蛋白酶脫蛋白處理時(shí)，天然多糖殘基上的硫酸根基團(tuán)受到氫氧根的親核攻擊大量脫落[11]，故DUP樣品的硫酸根基團(tuán)含量極顯著低于CUP樣品(P<0.01)；而CUP樣品的降解處理因在稀硫酸作用下進(jìn)行，對(duì)多糖的硫酸根基團(tuán)不產(chǎn)生明顯影響，故DCUP樣品的硫酸根基團(tuán)含量與其未降解的CUP樣品無顯著差異(P>0.05).

2.2 CUP、DUP及DCUP吸濕性和保濕性

如圖1所示，各樣品的吸濕率均隨時(shí)間顯著增大(P<0.05)，且3種石莼多糖樣品的吸濕率均極顯著高于殼聚糖、海藻酸鈉對(duì)照樣(P<0.01).在0～9 h內(nèi)，各樣品吸濕性大小順序依次為：DUP>甘油>CUP、DCUP>海藻酸鈉>殼聚糖；9 h后，各樣品吸濕性大小順序依次為：甘油>DUP>CUP、DCUP>海藻酸鈉>殼聚糖.值得注意的是，在試驗(yàn)時(shí)間范圍內(nèi)，CUP與DCUP樣品的吸濕率無顯著差異(P>0.05)；且24 h時(shí)，3種多糖樣品的吸濕率差異不顯著(P>0.05)，分別為(24.90±0.18)%、(24.75±0.01)%、(24.00±1.75)%.

圖1 石莼多糖及其脫蛋白與降解產(chǎn)物的吸濕性和保濕性Fig.1 Hygroscopicities and moisturizing capacities of CUP, DUP and DCUP

在空氣濕度較低的條件下，材料保持住自身水分的性質(zhì)稱為保濕性.如圖1所示，在整個(gè)試驗(yàn)過程中，各樣品的保濕率均隨時(shí)間的延長而極顯著下降(P<0.01)，保濕性大小順序依次為：甘油>DCUP>CUP>UDP>海藻酸鈉>殼聚糖；且在相同時(shí)間內(nèi)，前三者的保濕率極顯著大于后三者(P<0.01)，呈較明顯的兩極化；在48 h時(shí)，前三者的保濕率分別依次為(74.86±0.24)%、(64.77±1.80)%、(60.74±1.47)%，后三者的保濕率分別依次為(17.69±1.06)%、(13.25±0.23)%、(5.24±0.04)%.在相同時(shí)間內(nèi)，DUP樣品的保濕率均極顯著(P<0.01)低于甘油、CUP、DCUP樣品，但仍顯著(P<0.05)大于殼聚糖、海藻酸鈉.

表1 石莼多糖及其脫蛋白與降解產(chǎn)物的最松松密度Table 1 Bulk density of CUP, DUP and DCUP

由保濕性試驗(yàn)結(jié)果可以看出，CUP樣品的吸濕性顯著(P<0.05)小于DUP樣品，可能是由于本試驗(yàn)制備的DUP樣品較蓬松，粉體表面積較大，其最松松密度為CUP樣品的0.31倍(表1)，與水分子的有效接觸面積較大.CUP樣品的保濕性極顯著(P<0.01)大于DUP，可能是由于其脫蛋白產(chǎn)物DUP的硫酸根含量極顯著(P<0.01)低于CUP.前人的研究表明，多糖的硫酸根含量與保濕性呈正相關(guān)關(guān)系[12].而CUP樣品的吸濕性、保濕性與DCUP樣品無顯著差異(P>0.05)，可能是由于CUP樣品經(jīng)酸降解后雖生成大量親水性的羥基[13]，但因其結(jié)合蛋白在酸降解過程中也被水解，二者綜合的結(jié)果使得DCUP樣品的保濕性及吸濕性與CUP樣品無差異.多糖吸濕性強(qiáng)弱雖主要由親水基團(tuán)的數(shù)量及親水性強(qiáng)弱決定[14]，但粉體密度、硫酸根及蛋白質(zhì)含量亦會(huì)在一定程度上影響吸濕保濕性.

2.3 CUP、DUP及DCUP的體外抗氧化活性

本試驗(yàn)采用自由基清除率達(dá)到50%時(shí)的樣品濃度(即半抑制濃度，IC50)作為衡量樣品清除自由基能力的指標(biāo)，值越低則表示樣品的自由基清除力越強(qiáng).

2.3.1 對(duì)DPPH·的清除力 如圖2所示，在本研究的試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，CUP、DUP、DCUP的3種樣液與0.1 mg·mL-1VC溶液的DPPH·清除率均隨體積分?jǐn)?shù)的增大而極顯著增大(P<0.01)，且均在體積分?jǐn)?shù)為100%時(shí)達(dá)最大值，分別為(60.53±1.03)%、(42.68±1.81)%、(58.49±0.17)%、(68.01±0.92)%；3種樣液的DPPH·清除率均顯著(P<0.05)低于相同體積分?jǐn)?shù)下的0.1 mg·mL-1VC溶液；在體積分?jǐn)?shù)5%～20%范圍內(nèi)，CUP樣液的DPPH·清除率顯著(P<0.05)小于DUP樣液，而>40%后，CUP樣液的DPPH·清除率反而顯著大于DUP樣液(P<0.05).在5%～80%范圍內(nèi)，CUP樣液的DPPH·清除率顯著小于DCUP樣液(P<0.05)；但>80%后，二者的DPPH·清除率無顯著差異(P>0.05).

圖2 石莼多糖及其脫蛋白與降解產(chǎn)物的DPPH·清除力Fig.2 Scavenging capacities of CUP, DUP and DCUP on DPPH·

根據(jù)表2中的IC50值計(jì)算，可知CUP樣液的DPPH·清除力是0.1 mg·mL-1VC溶液的0.22倍、DUP樣液的1.65倍、DCUP樣液的1.66倍.

表2 石莼多糖及其脫蛋白與降解產(chǎn)物對(duì)DPPH·的半抑制濃度1)Table 2 Half maximal inhibitory concentration of CUP, DUP and DCUP on DPPH· scavenging reaction

1)CUP、DUP、DCUP樣液濃度為20 mg·mL-1，VC濃度為0.1 mg·mL-1.

2.3.2 對(duì)ABTS+·的清除力 如圖3所示，在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，CUP、DUP、DCUP 3種樣液對(duì)ABTS+·的清除力均隨體積分?jǐn)?shù)的增大而極顯著增大(P<0.01)，且均在100%時(shí)達(dá)最大值，分別為(57.52±2.05)%、(47.48±1.77)%、(71.80±2.29)%，3者均極顯著小于相同體積分?jǐn)?shù)下的0.1 mg·mL-1VC溶液(P<0.01)；在10%～30%范圍內(nèi)，0.1 mg·mL-1VC溶液對(duì)ABTS+·的清除率極顯著提高至100%(P<0.01).體積分?jǐn)?shù)>20%后， CUP樣液的ABTS+·清除率在各測試點(diǎn)均顯著大于DUP樣液(P<0.05)，而均顯著小于DCUP樣液(P<0.05).

圖3 石莼多糖及其脫蛋白與降解產(chǎn)物的ABTS+·清除力Fig.3 Scavenging capacities of CUP, DUP and DCUP on ABTS+·

根據(jù)表3的IC50值可得，CUP樣液的ABTS+·清除力是0.1 mg·mL-1VC溶液的0.08倍、DUP樣液的0.07倍、DCUP樣液的1.31倍.

表3 石莼多糖及其脫蛋白與降解產(chǎn)物對(duì)ABTS+·的半抑制濃度2)Table 3 Half maximal inhibitory concentration of CUP, DUP and DCUP on ABTS+· scavenging reaction

2)CUP、DUP、DCUP樣液濃度為20 mg·mL-1，VC濃度為0.1 mg·mL-1.

2.3.3 對(duì)·OH的清除力 如圖4所示，在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，0.4 mg·mL-1VC溶液及CUP、DCUP樣液的·OH清除率均隨其體積分?jǐn)?shù)的增大而極顯著增大(P<0.01)，均在100%時(shí)達(dá)最大值，分別為(98.78±0.27)%、(59.11±0.86)%、(98.78±0.32)%；且DCUP樣液的·OH清除率均極顯著高于相同體積分?jǐn)?shù)下的CUP、DUP樣液和0.4 mg·mL-1的VC溶液(P<0.01)，但在100%體積分?jǐn)?shù)時(shí)與0.4 mg·mL-1的VC溶液的等同；而DUP樣液的·OH清除率雖也隨其體積分?jǐn)?shù)的增大而增大，但增加幅度并不顯著(P>0.05)，當(dāng)體積分?jǐn)?shù)為100%時(shí)，·OH清除率僅為(25.61±0.67)%.根據(jù)表4的IC50值可得，CUP樣液的·OH清除力是0.4 mg·mL-1的VC溶液的0.64倍、DUP樣液的6.54倍、DCUP樣液的0.48倍.

圖4 石莼多糖及其脫蛋白與降解產(chǎn)物的·OH清除力Fig.4 Scavenging capacities of CUP, DUP and DCUP on·OH

待測樣液VCCUPDUPDCUPIC50/%49.28±0.1177.36±0.89505.88±22.0137.31±0.66

3)CUP、DUP、DCUP樣液濃度為10 mg·mL-1，VC濃度為0.4 mg·mL-1.

圖5 石莼多糖及其脫蛋白與降解產(chǎn)物的清除力Fig.5 Scavenging capacities of CUP, DUP and DCUPt on

表5 石莼多糖及其脫蛋白與降解產(chǎn)物對(duì)的半抑制濃度4)Table 5 Half maximal inhibitory concentration of CUP, DUP and DCUP on scavenging capacity

4)CUP、DUP、DCUP樣液濃度為30 mg·mL-1，VC濃度為0.1 mg·mL-1.

2.3.5 對(duì)鐵氰化鉀的還原力 如圖6所示，在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，各待測液對(duì)鐵氰化鉀的光密度(還原力)大小順序依次為：0.1 mg·mL-1VC溶液>CUP和DCUP樣液>DUP樣液.在任一體積分?jǐn)?shù)下，0.1 mg·mL-1VC溶液的還原力均極顯著高于3種待測樣液(P<0.01)，且所有樣液的還原力均隨其體積分?jǐn)?shù)的提高而極顯著增大(P<0.01)，并均在體積分?jǐn)?shù)為100%時(shí)達(dá)最大值，0.1 mg·mL-1VC及30 mg·mL-1CUP、DUP、DCUP樣液的最大還原力分別為(1.237±0.016)、(0.360±0.003)、(0.204±0.038)、(0.329±0.127).在相同體積分?jǐn)?shù)下，CUP樣液的還原力極顯著(P<0.01)大于DUP樣液，而與DCUP樣液無顯著差異(P>0.05).

圖6 石莼多糖及其脫蛋白與降解產(chǎn)物的鐵氰化鉀還原力Fig.6 Reducing ability of crude Ulva polysacchride and its deproteinated product and degradation product

3 結(jié)論

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