Trim59調(diào)控膀胱癌細(xì)胞侵襲及遷移能力的研究

趙 凱，陳 偉，苗陳巋，張 成，秦 超，賈瑞鵬，王增軍

(1.南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院泌尿外科，江蘇南京 210006；2.南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科，江蘇南京 210029；3.高郵市中醫(yī)醫(yī)院，江蘇揚(yáng)州 225600)

目前，膀胱癌的高復(fù)發(fā)率和死亡率給患者帶來(lái)了較差的預(yù)后[1-2]。因此需要我們進(jìn)一步尋找有效的分子標(biāo)記物并應(yīng)用于膀胱癌的早期診治。三基序蛋白Trim (tripartite motif containing)家族是一個(gè)進(jìn)化上保守的基因家族，與免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、神經(jīng)發(fā)育、細(xì)胞分化和腫瘤發(fā)生等密切相關(guān)[3-5]。Trim59 蛋白屬于Trim三基序家族的一員，具有一個(gè)ring finger domain、一個(gè)B-box domain、兩個(gè)卷曲螺旋和一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域。研究表明：Trim59 在上皮腫瘤細(xì)胞內(nèi)呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，可作為上皮性腫瘤的標(biāo)志物用于臨床早期診斷[6]；不僅可以促進(jìn)各種基質(zhì)的泛素化相關(guān)修飾，而且能在轉(zhuǎn)錄水平沉默特定的靶基因[7]。已有文獻(xiàn)報(bào)道Trim59可促進(jìn)前列腺癌、肺癌、胃癌、宮頸癌和骨肉瘤等腫瘤的發(fā)生發(fā)展[4，8-10]。然而Trim59在膀胱癌中表達(dá)情況的研究還較少，我們通過(guò)實(shí)驗(yàn)觀察Trim59調(diào)控膀胱癌細(xì)胞侵襲及遷移的能力。

1 材料與方法

1.1 組織和細(xì)胞 本研究收集了15對(duì)膀胱癌組織標(biāo)本，所有標(biāo)本均來(lái)自南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科行膀胱癌根治術(shù)的患者，標(biāo)本取好后立即保存于-80 ℃冰箱中。人膀胱癌細(xì)胞T24、5637和TCCSUP均購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)。T24和TCCSUP細(xì)胞使用DMEM培養(yǎng)基，5637細(xì)胞使用RPMI 1640的培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基中加入10% FBS以及雙抗100 U/mL配成完全培養(yǎng)基，置于5% CO2、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 細(xì)胞SiRNA轉(zhuǎn)染 待細(xì)胞生長(zhǎng)狀況良好并且融合度達(dá)到70%左右時(shí)，可以進(jìn)行細(xì)胞鋪板并準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前將培養(yǎng)皿中細(xì)胞消化鋪在6孔板中(細(xì)胞密度在70%左右)，在24 h內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。在進(jìn)行轉(zhuǎn)染前1 h更換無(wú)抗體培養(yǎng)基。按照說(shuō)明書上操作步驟利用Lipofectamine2000對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。干擾RNA購(gòu)買于上海吉瑪公司，序列(5′～3′)：Si-Trim59(CCCUGAACAUUACAGGCAATT); Negative(UUGCCUGUAAUGUUCAGGGTT)。細(xì)胞SiRNA轉(zhuǎn)染后，我們使用PCR技術(shù)檢測(cè)了Trim59敲低前后的mRNA表達(dá)量，對(duì)其敲低效率進(jìn)行了驗(yàn)證。

1.3 總RNA提取和RT-PCR 組織的標(biāo)本處理：天平稱取100 mg樣本，轉(zhuǎn)移至裝有1 mL Trizol的1.5 mL EP管中，剪刀剪碎樣本，電動(dòng)組織研磨設(shè)備充分勻漿。RNA提取全部過(guò)程均于冰上進(jìn)行，避免RNA降解。后續(xù)步驟與細(xì)胞標(biāo)本的RNA提取步驟相同。細(xì)胞標(biāo)本處理：6孔板中的每個(gè)孔棄去培養(yǎng)液，PBS洗滌2遍后分別滴入500 μL Trizol，置于冰上操作，靜置5 min后，使用移液器均勻充分吹打、抽吸貼壁細(xì)胞，將裂解液移入1.5 mL EP管中。后續(xù)以Trizol法提取總RNA。先取 1 μg RNA逆轉(zhuǎn)為cDNA，之后在取2 μL cDNA進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件如下：95 ℃，30 s；95 ℃，5 s，40個(gè)循環(huán);60 ℃，1 min。引物序列如下(5′～3′)：Trim59,Forward：5′-TGACTGACACACACTGGACA-3′;Reverse:5′-CTGCTGCTCTCGTATTTCCT-3′;β-actin:Forward:5′-ACTGGAACGGTGAAGGTGAC-3′;Reverse:5′-AGAGAAGTGGGGTGGCTTTT-3′。RT-PCR反應(yīng)和分析在ABl7900(Applied Biosystems，Carlsbad，USA) 系統(tǒng)上進(jìn)行。利用兩組△Ct差值來(lái)計(jì)算Trim59mRNA的相對(duì)表達(dá)量,即：△Ct Trim59=Ct Trim59-Ctβ-actin,△Ct normal=CTnormal-CTβ-actin，△△Ct=△Ct Trim59-△Ct normal，采用2-△△Ct法計(jì)算出膀胱癌組Trim59 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.4 Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn) 先消化細(xì)胞，終止消化后離心棄去培養(yǎng)液，用PBS洗1～2遍，用含0.2%BSA的無(wú)血清培養(yǎng)基重懸。調(diào)整細(xì)胞密度至5×105/mL。Transwell小室制備用50 mg/L Matrigel 1∶4稀釋液，取50 μL包被Transwell小室底部膜的上室面，37 ℃ 4 h，使Matrigel聚合成凝膠。然后取細(xì)胞懸液200 μL加入Transwell小室；下室加入600 μL含10% FBS 培養(yǎng)基，在37 ℃的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。之后取出Transwell小室，棄去孔中培養(yǎng)液，用無(wú)鈣的PBS洗2遍，甲醇固定30 min，將小室適當(dāng)風(fēng)干。0.1 %結(jié)晶紫染色20 min，用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細(xì)胞，用PBS洗3遍。在400倍顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野觀察細(xì)胞，計(jì)數(shù)。

1.5 蛋白印跡分析 人類膀胱癌細(xì)胞系T24和5637用含磷酸酶抑制劑的蛋白裂解液(RIPA∶PMSF=100∶1)(凱基生物技術(shù)，北京)處理提取總蛋白。蛋白樣品經(jīng)10%SDS-PAGE進(jìn)行電泳，300 mA電流轉(zhuǎn)膜2 h，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂牛奶于搖床上室溫封閉2 h。含有蛋白的PVDF膜孵育GAPDH，Vimentin，N-cadherin，matrix metalloprotein-9(MMP-9)抗體(CST，美國(guó))，4 ℃過(guò)夜。之后TBST洗膜3次，每次10 min，孵育含辣根過(guò)氧化物酶二抗(中杉金橋，北京)2 h，TBST洗膜3次，化學(xué)發(fā)光儀(Bio-Rad公司，美國(guó))曝光顯影。采用Image-Pro Plus軟件進(jìn)行分析的蛋白IOD值，目的蛋白的灰度值等于目的蛋白IOD/內(nèi)參蛋白IOD。

2 結(jié) 果

2.1 Trim59在膀胱癌組織及細(xì)胞系中高表達(dá) 15對(duì)膀胱癌組織驗(yàn)證的PCR結(jié)果顯示，與相對(duì)應(yīng)的癌旁組織相比，Trim59在膀胱癌組織中表現(xiàn)為高表達(dá)。另外，在3株膀胱癌細(xì)胞系中，T24和5637的Trim59mRNA表達(dá)水平較高于TCCSUP細(xì)胞，因此選取T24和5637細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)的研究。見(jiàn)圖1。

2.2 siRNA干擾對(duì)膀胱癌細(xì)胞Trim59表達(dá)水平的影響 因?yàn)門rim59在膀胱癌細(xì)胞中高表達(dá)，通過(guò)使用特異性的siRNA敲低Trim59后，PCR結(jié)果顯示si-Trim59組的Trim59的表達(dá)量顯著小于陰性對(duì)照組NC，從而證明針對(duì)Trim59設(shè)計(jì)的siRNA能夠有效沉默膀胱癌細(xì)胞中Trim59的表達(dá)。見(jiàn)圖2。

圖1 Trim59 mRNA在膀胱癌組織及細(xì)胞系中高表達(dá)

A：與正常組織相比，腫瘤組織中Trim59 mRNA表達(dá)量明顯較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(*P<0.05，n=15)；B:3株細(xì)胞系中Trim59 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

2.3 沉默Trim59可抑制膀胱癌細(xì)胞的遷移能力 Transwell遷移實(shí)驗(yàn)顯示：與陰性對(duì)照組相比，在T24和5637細(xì)胞系中，si-Trim59組穿過(guò)室內(nèi)膜的膀胱癌細(xì)胞的數(shù)量明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖3)。結(jié)果表明沉默Trim59可抑制膀胱癌細(xì)胞的遷移能力。

圖2 沉默Trim59對(duì)T24和5647細(xì)胞系中

A：T24細(xì)胞中,與陰性對(duì)照組或空白組相比，si-Trim59組Trim59 mRNA水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(*P<0.05);B：5637細(xì)胞中,與陰性對(duì)照組或空白組相比，si-Trim59組Trim59 mRNA水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(*P<0.05)。

圖3 沉默Trim59對(duì)膀胱癌細(xì)胞遷移能力的影響

A：T24和5637細(xì)胞遷移；B：T24和5637遷移分析柱狀圖。兩組比較：*P<0.05(n=3)。

2.4 沉默Trim59可抑制膀胱癌細(xì)胞的侵襲能力 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)顯示：與陰性對(duì)照組相比，在T24和5637細(xì)胞系中，si-Trim59組穿過(guò)室內(nèi)膜的膀胱癌細(xì)胞的數(shù)量明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖4)。結(jié)果表明沉默Trim59可抑制膀胱癌細(xì)胞的侵襲能力。

圖4 沉默Trim59對(duì)膀胱癌細(xì)胞侵襲能力的影響

A:T24和5637細(xì)胞侵襲；B：T24和5637細(xì)胞侵襲分析柱狀圖。兩組比較：*P<0.05(n=3)。

2.5 沉默Trim59對(duì)epithelial-mesenchymal transition(EMT)相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 Western bolt檢測(cè)結(jié)果顯示：與陰性對(duì)照組相比，在T24和5637細(xì)胞系中，沉默Trim59能夠顯著下調(diào)間質(zhì)表型蛋白Vimentin和N-cadherin表達(dá)水平，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果表明沉默Trim59能夠抑制膀胱癌細(xì)胞EMT過(guò)程。另外，我們發(fā)現(xiàn)在T24和5637細(xì)胞中，沉默Trim59后MMP-9蛋白水平明顯下調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖5 轉(zhuǎn)染si-Trim59后T24和5637細(xì)胞系中Vimentin、N-cadherin和MMP-9蛋白的表達(dá)

A:Western blot檢測(cè)；B：T24細(xì)胞中3種蛋白表達(dá)灰度分析柱狀圖；C：5637細(xì)胞中3種蛋白表達(dá)灰度分析柱狀圖。

3 討 論

作為超家族蛋白的一員，有文獻(xiàn)報(bào)道稱Trim59涉及到許多生物學(xué)過(guò)程并充當(dāng)了重要的調(diào)節(jié)作用，包括腫瘤的發(fā)生、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡等[11]。據(jù)報(bào)道Trim59在許多惡性腫瘤內(nèi)高度表達(dá)，比如前列腺癌、胃癌等[4，8]。Trim59的高表達(dá)可促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移，并且與腫瘤的臨床分期緊密相關(guān)[4，9]。然而Trim59在膀胱癌中的表達(dá)情況及生物學(xué)功能尚鮮見(jiàn)報(bào)道，機(jī)制還不明確。

本研究中,我們已經(jīng)證明人膀胱癌組織中Trim59的mRNA是高表達(dá)的。在培養(yǎng)的3種細(xì)胞器中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)T24和5637細(xì)胞系中Trim59的mRNA相對(duì)表達(dá)量較TCCSUP細(xì)胞系中的表達(dá)量要高。因而我們選取了T24和5637這兩個(gè)細(xì)胞系進(jìn)行后續(xù)的功能學(xué)研究。通過(guò)使用特定的siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Trim59敲低后，膀胱癌細(xì)胞的生物學(xué)行為受到影響。通過(guò)沉默Trim59，發(fā)現(xiàn)T24和5637細(xì)胞的遷移和侵襲能力發(fā)生明顯下降。為了進(jìn)一步研究Trim59對(duì)膀胱癌細(xì)胞遷移和侵襲能力影響的具體的分子機(jī)制，我們檢測(cè)了多個(gè)相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在沉默T24和5637細(xì)胞中Trim59的表達(dá)后，N-cadherin、Vimentin和MMP-9蛋白的表達(dá)下降。N-cadherin和Vimentin屬于上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程中的間質(zhì)標(biāo)志物。沉默Trim59后，間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin和Vimentin發(fā)生下調(diào)，表明上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化的過(guò)程受到了抑制。在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，EMT過(guò)程能夠使得上皮腫瘤細(xì)胞逐漸失去其極性，細(xì)胞與細(xì)胞間的緊密連接結(jié)構(gòu)逐步降解，與此同時(shí)，腫瘤細(xì)胞骨架發(fā)生重組并且獲得了間質(zhì)細(xì)胞的特性，這一特性導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞能夠穿過(guò)組織的基底膜并轉(zhuǎn)移播散至遠(yuǎn)處器官組織，從而促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展轉(zhuǎn)移[12]。此前，EMT過(guò)程已經(jīng)被證明是可以引起一系列的腫瘤學(xué)行為，例如增強(qiáng)侵襲、遷移和轉(zhuǎn)移[13]。MMP-9屬于基質(zhì)金屬蛋白酶家族，可以降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜，從而誘導(dǎo)細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[14]。除此之外，在多個(gè)腫瘤中上調(diào)MMP-9的表達(dá)能夠增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移的能力[15-16]。沉默Trim59后，由于MMP-9的表達(dá)量下降了，從而削弱了MMP-9在促進(jìn)細(xì)胞侵襲及遷移的過(guò)程中可能發(fā)揮的作用。上述結(jié)果表明沉默Trim59可通過(guò)調(diào)控EMT過(guò)程抑制膀胱癌細(xì)胞的遷移及侵襲。這些結(jié)果揭示了如下分子機(jī)制：在膀胱癌細(xì)胞中，沉默Trim59通過(guò)調(diào)控EMT過(guò)程抑制膀胱癌細(xì)胞的遷移及侵襲。

綜上所述，我們的研究明確了Trim59在膀胱癌中的生物學(xué)作用。通過(guò)siRNA敲低Trim59并通過(guò)調(diào)控EMT過(guò)程抑制膀胱癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。本研究的結(jié)果加深了我們對(duì)于膀胱腫瘤發(fā)展轉(zhuǎn)移的認(rèn)識(shí)，同時(shí)也可將Trim59作為膀胱癌治療的一個(gè)潛在靶點(diǎn)。

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