心肌梗死中l(wèi)ncRNAs、mRNAs基因表達譜分析

李珊珊，王悅竹，宋一帆，白雪峰

（哈爾濱醫(yī)科大學大慶校區(qū)醫(yī)學信息學院，黑龍江 大慶 163319）

0 引言

心血管病患病率及死亡率仍將不斷上升，而其中尤其嚴重的是急性心肌梗塞。臨床上急性心肌梗死發(fā)病率高，預后多不良，已經引起醫(yī)學界的高度關注。急性心肌梗塞(acute myocardial infarction，AMI)是全球范圍內指致死和致殘的主要疾病之一。

國內外對心肌梗死的生物學標志進行了大量而廣泛的研究。研究發(fā)現lncRNA在心肌梗死中更為靈活的調控多個mRNA在通路中的異常表達。

研究證實，有些lncRNA通過靶向作用于其他基因參與調控病理性心肌細胞凋亡[1]，有些lncRNA在梗死組織中被發(fā)現通過抑制其表達可以減弱心肌梗死[2-3]。還有些在外周血中被發(fā)現這些lncRNA可能在AMI的發(fā)展中具有潛在作用[4-5]。lncRNA還可作為 ceRNA參與調控細胞死亡，Wang等[6]發(fā)現了一種lncRNA APF(autophagy promoting factor)可以調節(jié)細胞自噬。人體發(fā)生急性心肌梗塞后體內的mRNAs和lncRNAs表達異常，通過轉錄后水平參與MI及其并發(fā)癥的病理生理過程，有望成為急性心肌梗死新的生化標志物和治療靶點。

本文根據mRNA與lncRNA的概述以及近年來心肌梗塞與mRNA和lncRNA的相關研究進程來討論mRNA-lncRNA相互作用的調控機制對心肌梗死發(fā)生與發(fā)展過程的影響，為研究者在mRNAs、lncRNAs和AMI診斷方面的研究提供幫助。

1 lncRNA與心肌梗塞

1.1 數據準備

我們從NCBI上下載平臺數據（GPL96）、基因芯片數據（GSE974）和GENECODE數據庫中下載人類的基因序列，利用計算機軟件建庫比對，對lncRNA與mRNA進行分離。芯片數據包括38個病人樣本（16 normal/22 MI），對平臺數據進行探針重注釋得出11083個mRNA和382個lncRNA。通過SAM算法選取差異基因，通過R語言進行數據處理選取的差異的mRNA和lncRNA（foldchange＞2）,得到了9937個差異mRNA和86個差異lncRNA。這些差異表達的mRNA和lncRNA作為心肌梗死的潛在致病因素。利用R語言構出mRNA與lncRNA互做網絡（pearson＞0.8）用Cytoscape插件對網絡進行功能模塊挖掘，獲得5個功能顯著性模塊，最后通過David進行基因的功能注釋，結果見圖1。

1.2 表達譜網絡分析

得到mRNA-lncRNA互作網絡，結點數1309個，其中包含1276個mRNA和33個lncRNA，1680條邊。網絡圖中的點代表基因，邊表示兩個基因間的聯系，其中度越大的基因表示與其連接的基因越多，表明在網絡中可能起著重要作用。另外，還存在一些雖然度小但在網絡圖中起橋梁作用的結點。這些節(jié)點可能作為MI中的潛在的致病基因。

圖1 數據分析流程圖

1.3 網絡模塊挖掘

對HPRD網絡與共表達網絡進行整合構建更為全面的lncRNA-mRNA互作網絡，其中包括33個lncRNA，4522個mRNA，9134條邊。利用Cytoscape中的JActivemodule和Netmine插件進行模塊挖掘。獲得5個功能性顯著模塊（module1-module5）。

1.4 Gene ontology(GO)分析

通過David在線平臺進行對模塊中重要基因進行功能注釋，篩選出具有診斷意義的基因。分析后的結果發(fā)現lncRNA在心肌梗死發(fā)病機制中扮演多重角色。

2 結果

2.1 差異表達lncRNAs、mRNAs

圖2 lncRNA 表達譜熱圖

圖3 mRNA 表達譜熱圖

對MI表達譜數據進行處理，得到的差異lncRNA與mRNA數量分別為86/9937個 。我們根據foldchange值進行排序，提取了差異mRNA前0.5%的表達譜與差異lncRNA前5%的表達譜繪制熱圖，結果見圖2、3。樹狀圖表示對來自不同樣本的不同基因的聚類分析結果，從整體上來看疾病組與對照組在基因表達上有顯著差異。

2.2 miRNAs-mRNAs網絡模塊

對建立的疾病網絡已經證明顯現冪律分布[7],從網絡分析來看，網絡中結點度越大的點，表明可能會影響更多的鄰居結點，因此，這些點被考慮扮演hubs結點的角色。圖4顯示lncRNAs-mRNAs網絡結點的度分布是冪律分布。通過模塊挖掘來研究lncRNAs、mRNAs在癌癥當中的共調控方式、以及基于局部策略來分析miRNAs的在心肌梗塞中的功能。

圖4 網絡度分布

根據得到的5個功能模塊當中，大部分 lncRNAs具 有 較 大 的 度， 如：LINC00483、AL031598、AC009283、AC126365、H19、AP000654等，結果見表1。在各個模塊中有些結點的度較大，AP000654在模塊四、五的度數為：18、20。模塊一中度較大的節(jié)點GNAQ,它的度數為17，同時該基因已被研究證實參與調節(jié)多種細胞活動，包括細胞增殖、分化和凋亡，并在損傷和動脈粥樣硬化的血管中參與反應。研究表明有多個基因能夠促進動脈粥樣硬化,例如：lncRNA H19通過調節(jié)MAPK和NF-kB信號通路來促進動脈粥樣硬化的形成[8]。動脈粥樣硬化可能會導致人體發(fā)生心肌梗死。模塊二中度較大的節(jié)點IGF2R可能在調節(jié)心肌細胞生長和凋亡中發(fā)揮重要作用[9]。模塊四中的MMP1，MMP2，MMP7，MMP9，MMP12和MMP13 也被文獻證實在心肌梗死發(fā)病機制中起到重要作用[10]。

表1 各模塊中邊、點數量和所含lncRNAs,mRNAs數量

在五個模塊中，對模塊進一步分析，通過clusterone插件對模塊進行挖掘，通過挖掘每個模塊中重要節(jié)點用紅色標出，結果見圖5。這表明除了度大的點起到了HUB結點的作用，在網絡中還有一些結點度雖然小，在局部聯系較為緊密，成為一個團隊發(fā)揮著作用,這些合作的結點可能在疾病發(fā)生過程中起到作用。在模塊二中TGFA、MAGI2、ADAM17聚在一個集合中，其中已被研究證實的增強ADAM17表達與大鼠急性心肌梗死后心肌重塑相關[11]。模塊四中ZC3H12A是位于人類一號染色體上的基因，已有文獻證實該基因與AHSP、HBA2存在互作關系?；騔C3H12A別名為MCPIP，近期研究發(fā)現MCPIP在缺血心肌組織中的表達可以通過調節(jié)局部心肌炎癥來保護MI后的心臟重塑[12]。

圖5 lncRNAs-mRNAs功能顯著性模塊

2.3 模塊功能分析

根據得到的五個模塊的功能注釋結果，我們發(fā)現多個模塊中的多個基因都被注釋到血管內皮生長因子的生產調節(jié)、炎癥反應、細胞凋亡，結果見圖6。其中模塊三中的C3和C5被注釋到與血管內皮生長因子的生產調節(jié)與炎癥反應。模塊一中的基因還被注釋到多對相反功能上，如：regulation of apoptotic process in bone marrow和negative regulation of vascular endothelial growth factor signaling pathway，regulation of vascular endothelial growth factor signaling pathway和negative regulation of vascular endothelial growth factor signaling pathway。這表明其實組織中本身就存在平衡調控機制，若這些機制失衡也會導致疾病發(fā)生。

3 結語

圖6 模塊功能注釋

為了探究心肌梗死中l(wèi)ncRNA與mRNA的調控機制，我們通過對心肌梗死芯片數據進行分析，得到lncRNA-mRNA網絡，并且對網絡進行模塊挖掘獲得五個顯著性模塊，對模塊進行分析LINC00483、AL031598、AC009283、AC126365、H19、AP000654在網絡中起到了HUB節(jié)點的作用，在網絡中還有一些結點度雖然小，但在局部聯系較為緊密，成為一個團隊發(fā)揮著重要作用, 如：TGFA、MAGI2、ADAM17。其中regulation of apoptotic process in bone marrow和negative regulation of vascular endothelial growth factor signaling pathway出現在多個模塊功能注釋中。通過本文的研究，發(fā)現lncRNA與mRNA協(xié)同作用，為研究者在lncRNAs、mRNAs和MI診斷方面的研究提供幫助。

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