外泌體蛋白質(zhì)組學(xué)分析在心血管疾病中應(yīng)用的研究進(jìn)展*

翁 震，何 楊 (蘇州大學(xué)唐仲英血液學(xué)研究中心，江蘇蘇州 215123)

外泌體是大小為30～100 nm的細(xì)胞外囊泡，其通常存在于細(xì)胞培養(yǎng)上清液中并天然存在于人體的各種體液中(包括血液、尿液及母乳)［1］。研究發(fā)現(xiàn)，包括微小RNA和蛋白質(zhì)在內(nèi)的多種生物分子存在于外泌體中［2］。在眾多外泌體蛋白分子中，存在許多具有重要生物學(xué)功能的蛋白［3，4］。以質(zhì)譜(mass spectrometry，MS)技術(shù)為基礎(chǔ)的蛋白組學(xué)作為蛋白鑒定和定量及表征蛋白質(zhì)的翻譯后修飾的工具［5］，因其能夠提供機(jī)制、功能及疾病關(guān)聯(lián)方面的重要信息，而被應(yīng)用于外泌體蛋白的分析并在過去幾年進(jìn)展迅速［6，7］。此外，臨床樣本來源外泌體蛋白質(zhì)組學(xué)分析能夠作為疾病診斷和預(yù)后生物標(biāo)記物進(jìn)行應(yīng)用［8，9］。由此可見，有效的外泌體蛋白質(zhì)組學(xué)分析具有實(shí)際意義，因此有必要對(duì)最新的進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 外泌體蛋白MS法鑒定和定量分析

1.1 外泌體蛋白鑒定 液相色譜偶聯(lián)質(zhì)譜(liquid chromatography coupled mass spectrometry，LC-MS)能夠?qū)⑼饷隗w來源的蛋白樣品在反向柱上進(jìn)行分離。然后，經(jīng)柱洗脫樣品通過電噴霧離子化，使樣品成分帶電并在質(zhì)譜儀中蒸發(fā)，通過檢測(cè)樣品蛋白的質(zhì)量和電荷實(shí)現(xiàn)蛋白的鑒定。一般情況下，采用串聯(lián)MS(或MS/MS)能夠進(jìn)一步將前體離子分解成碎片(產(chǎn)物離子)以獲得肽測(cè)序的信息。LC-MS/MS已被確立為能夠有效分離和鑒定蛋白質(zhì)的最強(qiáng)大工具之一。然而，僅LC-MS/MS不足以研究蛋白質(zhì)相互作用，也不能區(qū)分來自不同來源的蛋白質(zhì)及不同來源的相同蛋白質(zhì)的相對(duì)豐度。為了克服這些問題，開發(fā)了其他MS相關(guān)方法，例如免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation，Co-IP)，串聯(lián)親和純化(tandem affinity purification，TAP)，相對(duì)和絕對(duì)定量的同量異位標(biāo)簽(isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ)和細(xì)胞培養(yǎng)中氨基酸穩(wěn)定同位素標(biāo)記(stable isotope labeling with amino acids in cell culture，SILAC)。

1.2 外泌體蛋白標(biāo)記和定量 iTRAQ和SILAC與MS結(jié)合的方法，已被廣泛用于比較和定量蛋白的豐度的差異。對(duì)于iTRAQ，不同來源的外泌體蛋白經(jīng)消化后與不同iTRAQ標(biāo)簽在體外通過生化反應(yīng)進(jìn)行標(biāo)記。對(duì)于SILAC，標(biāo)記過程通過摻入代謝相關(guān)同位素氨基酸得以實(shí)現(xiàn)。在使用這兩種技術(shù)標(biāo)記和純化后，所有樣品能夠在合并后通過MS分析進(jìn)行鑒定并實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的定量。雖然SILAC和iTRAQ能夠用于外泌體蛋白的檢測(cè)，但它們各有優(yōu)缺點(diǎn)。通常情況下，如果涉及兩個(gè)樣品，SILAC是一種可靠的方法，因其易于實(shí)施并且標(biāo)記變異性較低。然而，由于SILAC依賴于氨基酸在蛋白質(zhì)合成過程中的摻入，使得該技術(shù)最適合快速增殖的細(xì)胞系而非緩慢增殖的原代細(xì)胞。對(duì)于后一種情況，iTRAQ更適合。另外，iTRAQ能夠多次使用并可以同時(shí)比較最多10個(gè)樣本。此外，還可以使用基于光譜計(jì)數(shù)或前體信號(hào)強(qiáng)度的無標(biāo)簽蛋白質(zhì)組學(xué)方法，但這些方法的缺點(diǎn)在于定量精確度不高且需要大量的計(jì)算［10］。

1.3 外泌體蛋白相互作用 Co-IP和TAP是與MS分析結(jié)合使用以研究蛋白質(zhì)相互作用的最常見的兩種分離技術(shù)。Co-IP通過運(yùn)用針對(duì)已知外泌體蛋白的抗體，將外泌體蛋白及相關(guān)蛋白進(jìn)行沉淀后將沉淀的復(fù)合物進(jìn)行MS分析。而TAP則是將感興趣的蛋白質(zhì)與含有蛋白酶切割位點(diǎn)的TAP標(biāo)簽融合。首先，將外泌體蛋白提取物通過與TAP標(biāo)簽特異性抗體結(jié)合的瓊脂糖微球柱，獲得捕獲期望的蛋白和相關(guān)蛋白。隨后，通過蛋白酶消化將蛋白復(fù)合物從微球中釋放進(jìn)行肽測(cè)序鑒定。Co-IP和TAP都適用于蛋白質(zhì)相互作用研究，特別是未知蛋白的相互作用。Co-IP還被證實(shí)能夠有效分離可溶性蛋白和膜蛋白，這些蛋白在外泌體中含量豐富。需要注意的是，Co-IP和TAP僅適用于穩(wěn)定的相互作用，但是它們無法區(qū)分直接還是間接相互作用。

2 外泌體蛋白組學(xué)分析在心血管疾病中的應(yīng)用

2.1 疾病診斷價(jià)值 來自患者體液(如血漿、尿液等)的蛋白質(zhì)組學(xué)分析能夠發(fā)現(xiàn)疾病相關(guān)的生物標(biāo)記物。早期的研究通過蛋白組學(xué)發(fā)現(xiàn)人血漿外泌體中存在過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPAR-γ)可能參與到旁分泌效應(yīng)功能發(fā)揮中［11］。Damkjaer等人［12］利用高速離心從原發(fā)性高血壓患者中分離純化了尿液外泌體，并采用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法檢測(cè)了外泌體相關(guān)蛋白，結(jié)果顯示有12種蛋白僅在患者中出現(xiàn)，其中維甲酸誘導(dǎo)基因2蛋白水平下降，而其他蛋白的水平增加。該結(jié)果表明外泌體蛋白可能參與疾病的發(fā)生發(fā)展過程。

2.2 疾病治療應(yīng)用反映微血管病變 作為無毒細(xì)胞來源的脂質(zhì)納米囊泡，外泌體可以有效地將生物活性分子遞送至受體細(xì)胞，并且如果能夠合理地設(shè)計(jì)它們的跨膜肽，甚至能賦予受體細(xì)胞高度靶向特異性。Chen等［13］最近發(fā)現(xiàn)尿液干細(xì)胞來源外泌體高表達(dá)惡性腦瘤剔除基因1(the gene deleted in malignant brain tumors 1，DMBT1)，并且能夠通過DMBT1促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的成血管效應(yīng)，該策略有望應(yīng)用于糖尿病軟組織的傷口愈合。Gonzalez-Calero等［14］人利用iTRAQ技術(shù)并結(jié)合靶點(diǎn)分析確認(rèn)高血壓患者尿液外泌體存在48種與高血壓癥狀有關(guān)的蛋白，其中21種存在于3個(gè)主要功能基因簇中，分別為糖胺聚糖降解、凝血和補(bǔ)體系統(tǒng)以及氧化應(yīng)激。他們認(rèn)為這些功能蛋白簇為高血壓患者新型治療方案的開發(fā)提供了重要的信息。另外，低氧應(yīng)激也能夠影響外泌體的組成，Cosme等人［15］通過蛋白組學(xué)分析了低氧和常氧處理后的心臟成纖維細(xì)胞外泌體蛋白成分差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)低氧能夠引起胞外基質(zhì)信號(hào)相關(guān)蛋白表達(dá)水平增高。而之前的綜述認(rèn)為低氧處理的外泌體在心血管疾病中的治療效果更佳［16］。最近，Barile等［17］人通過蛋白組學(xué)發(fā)現(xiàn)心臟前體細(xì)胞外泌體表面的孕相關(guān)漿蛋白A(pregnancy-associated plasma protein A，PAPP-A)蛋白能夠通過蛋白酶解胰島素生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白4(insulin-like growth factor binding protein-4，IGFBP-4)，引起胰島素生長(zhǎng)因子1受體(insulin-like growth factor-1 receptor，IGF-1R)活化來減少心肌細(xì)胞的凋亡，從而發(fā)揮心臟保護(hù)作用，這無疑提出了外泌體發(fā)揮治療效應(yīng)的新機(jī)制，即:通過表面活化蛋白酶來釋放后與鄰近配體相互作用來發(fā)揮效應(yīng)。

另外，目前有三項(xiàng)研究報(bào)道了有關(guān)血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)來源外泌體蛋白組學(xué)分析的結(jié)果。Comelli等［18］人首先通過蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定了豬冠狀動(dòng)脈VSMCs外泌體中的64種蛋白質(zhì);而Kapustin等［19］人通過蛋白組學(xué)分析患者主動(dòng)脈來源原代VSMCs外泌體鑒定了345種蛋白質(zhì)。在這兩項(xiàng)研究中，總共鑒定了387種蛋白質(zhì)。最近，Qiu等［20］人在VSMCs外泌體中鑒定出459種蛋白質(zhì)，通路分析顯示這些蛋白參與179個(gè)細(xì)胞成分，120個(gè)分子功能和337個(gè)生物學(xué)過程，其中細(xì)胞-細(xì)胞黏附和血小板活化/凝固排在最前。

另外，他們認(rèn)為VSMCs外泌體的主要功能是維持血管動(dòng)態(tài)平衡。由于VSMCs是心血管疾病中的重要參與細(xì)胞，這些研究無疑為明確和干預(yù)VSMCs提供了可能。

3 外泌體蛋白組學(xué)研究展望目前不同來源外泌體在心血管疾病診斷和治療中已顯示出臨床應(yīng)用的可能，然而目前的研究均為實(shí)驗(yàn)室級(jí)別，因此需要在將來進(jìn)一步進(jìn)行臨床試驗(yàn)來驗(yàn)證外泌體的診斷效率及治療效果?？傊鞍踪|(zhì)組學(xué)技術(shù)的進(jìn)展在研究外泌體的基礎(chǔ)生物學(xué)，探索外泌體疾病發(fā)病機(jī)制，開發(fā)和監(jiān)測(cè)外泌體治療劑的功效等方面發(fā)揮核心作用。然而，相關(guān)探索性嘗試的廣度仍然有限，另外生物學(xué)上對(duì)外泌體包裝和釋放的調(diào)節(jié)機(jī)制的認(rèn)識(shí)有限及受到外泌體分離和純化方法的限制，目前關(guān)于外泌體蛋白組學(xué)分析的數(shù)據(jù)仍有待進(jìn)一步證實(shí)，而有效的解決這些問題將極大有利于對(duì)理解疾病發(fā)病機(jī)制和疾病適用性。