一種戈謝病突變基因檢測(cè)方法的建立

鄭文彥

（廣東華美眾源生物科技有限公司，廣東佛山528000）

戈謝?。℅aucher Disease，簡(jiǎn)稱(chēng)GD）又名葡糖腦苷脂酶缺乏癥，是溶酶體貯積病中最常見(jiàn)的一種，為常染色體隱性遺傳。編碼葡糖腦苷脂酶的基因（Glucocerebmsidas，以下簡(jiǎn)述GBA）突變會(huì)造成該酶的缺乏，從而引起葡糖腦苷脂在肝、脾、骨骼和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的單核巨噬細(xì)胞內(nèi)蓄積，導(dǎo)致受累組織器官病變，產(chǎn)生肝脾腫大、骨骼畸形、貧血、生長(zhǎng)發(fā)育落后、神經(jīng)系統(tǒng)異常等臨床表現(xiàn)［1-5］。

對(duì)于戈謝病的臨床診斷，酶學(xué)及骨髓細(xì)胞學(xué)的方法最為常用。其中，通過(guò)測(cè)量外周血白細(xì)胞或者皮膚成纖維細(xì)胞中葡糖腦苷脂酶的活性的葡萄糖腦苷脂酶活性檢測(cè)法是“金標(biāo)準(zhǔn)”［6-9］。當(dāng)外周血白細(xì)胞或皮膚成纖維細(xì)胞中葡萄糖腦苷脂酶活性降低至正常值的30%以下時(shí)，即可確診戈謝?。?0］。但有少數(shù)患者雖然具有戈謝病臨床表現(xiàn)，其葡萄糖腦苷脂酶活性低于正常值低限卻又高于正常值的30%，此時(shí)需要進(jìn)一步的檢測(cè)以實(shí)現(xiàn)確診。

隨著對(duì)戈謝病病因?qū)W認(rèn)識(shí)的不斷加深和研究的深入，基因檢測(cè)技術(shù)已經(jīng)使戈謝病診斷更加準(zhǔn)確，不但可以使戈謝病患者得到確切診斷，還可以診斷基因攜帶者、追究其遺傳學(xué)來(lái)源［11］。此外，通過(guò)對(duì)戈謝病患者家族成員進(jìn)行GBA基因檢測(cè)，進(jìn)行遺傳咨詢(xún)，可明確戈謝病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，降低后代戈謝病發(fā)病率，減輕患者的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)負(fù)擔(dān)。

戈謝病為常染色體隱性遺傳病，目前已發(fā)現(xiàn)的GBA基因突變類(lèi)型達(dá)400多種，表型復(fù)雜［8，12］。GBA基因的突變類(lèi)型具有種族差異，在德系猶太人中，N370S（c.1226A>G）、L444P（c.1448T>C）、IVS2+1（c.115+1G>A）以及84GG（c.84dupG）這4種突變占了90%［13］。而中國(guó)戈謝病人GBA基因突變分析顯示最常見(jiàn)的突變主要是 L444P（c.1448T>C），約占 33%，其次還有 N188S（c.680A>G），F(xiàn)213I（c.754T>A），D409H（c.1342G>C）等，N370S（c.1226A>G）突變?cè)谥袊?guó)戈謝病人中比較罕見(jiàn)［14-15］。

結(jié)合上述情況，本研究選取文獻(xiàn)記載的4個(gè)中國(guó)人群突變頻率較高的GBA基因位點(diǎn)N188S、F213I、D409H、L444P，建立了一種簡(jiǎn)單快捷，運(yùn)用多重?zé)晒馄瑪喾治鰜?lái)進(jìn)行GBA基因檢測(cè)的方法。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

擴(kuò)增目的基因位點(diǎn)的引物及GBA基因片段的人工合成序列由深圳百邁生物公司合成，其他試劑主要包括PCR緩沖液和熱啟動(dòng)C-Taq酶購(gòu)自無(wú)錫中德美聯(lián)生物有限公司。

樣本采用Eppendorf 9700 PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物用3130XL型遺傳分析儀（ABI公司，美國(guó)）進(jìn)行電泳檢測(cè)。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GBA的主要四個(gè)高頻率基因突變位點(diǎn)，設(shè)計(jì)了四組熒光引物，每組包括一條帶熒光的上游引物和兩條識(shí)別野生（w）/突變（m）分型的下游引物，引物序列如表1所示。擴(kuò)增產(chǎn)物排布圖如圖1所示。

表1 熒光復(fù)合擴(kuò)增引物

圖1 擴(kuò)增產(chǎn)物排布圖

1.2.2 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

在一個(gè) 25 μL 的 PCR 反應(yīng)體系中含有：DNA 模板 0.5-2.0 ng；混合引物（10 μM）1.0 μL；2X PCR緩沖液 12.5 μL；C-Taq 酶（5 U/μL）1.0 μL；余下用 SdH2O 補(bǔ)足。

PCR反應(yīng)程序：熱啟動(dòng)95℃ 2 min；第一個(gè)大循環(huán)（10個(gè)循環(huán)）94℃ 30 sec，60℃ 30 sec，72℃ 30 sec；第二個(gè)大循環(huán)（18個(gè)循環(huán)）94℃ 30 sec，59℃ 30 sec，72 ℃ 30 sec；終延伸72 ℃10 min；4℃保溫。

1.2.3 GBA基因分型

運(yùn)用ABI3130XL遺傳分析儀，進(jìn)行下列操作：12 μL去離子甲酰胺與0.5 μL分子量?jī)?nèi)標(biāo)Marker SIZ-500（無(wú)錫中德美聯(lián)有限公司，中國(guó)）混合。再加入1 μLPCR反應(yīng)產(chǎn)物，渦旋混勻3 500 r/min離心2 min，95℃變性 3 min，-20℃冰孵3 min，后進(jìn)行毛細(xì)管電泳。運(yùn)用GeneMapperIDX（Applied Biosystems）軟件結(jié)合產(chǎn)物排布設(shè)置對(duì)GBA基因分型結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 野生型樣本分型結(jié)果

使用9947A基因組及9948基因組DNA作為模板，按上述方法進(jìn)行復(fù)合擴(kuò)增及毛細(xì)管電泳的結(jié)果如圖2、3所示。N188S、F213I、D409H、L444P四個(gè)基因位點(diǎn)均在野生型（W）位置出峰，表明樣本9947A和9948的這四個(gè)基因位點(diǎn)均為純合野生型。

圖2 樣本9947A分型結(jié)果

圖3 樣本9948分型結(jié)果

2.2 突變型樣本分型結(jié)果

使用人工合成的四個(gè)基因座均為突變型的GBA基因片段作為模板，進(jìn)行復(fù)合擴(kuò)增及毛細(xì)管電泳的結(jié)果如圖4所示。N188S、F213I、D409H、L444P四個(gè)基因位點(diǎn)均在突變型（M）位置出峰，表明引物的設(shè)計(jì)符合預(yù)期，可以成功擴(kuò)增并電泳獲得純合突變型的分型結(jié)果。

圖4 突變型樣本分型結(jié)果

2.3 GBA基因分型標(biāo)準(zhǔn)物

按比例調(diào)配擴(kuò)增產(chǎn)物獲得的分型標(biāo)準(zhǔn)物制作成標(biāo)準(zhǔn)分型（ladder），做為標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)毛細(xì)管電泳后，結(jié)果如圖5所示。

圖5 GBA基因分型標(biāo)準(zhǔn)物

2.4 實(shí)際病例樣本分型結(jié)果

應(yīng)用本方法對(duì)兩例戈謝病患者的血液樣本進(jìn)行檢測(cè)，毛細(xì)管電泳結(jié)果如圖6、7所示，兩例患者的基因分型分別為L(zhǎng)444P突變型及N188S突變型。

圖6 戈謝病患者1的基因分型結(jié)果

圖7 戈謝病患者2的基因分型結(jié)果

3 討論

戈謝病是常染色體隱性遺傳病，與GBA基因突變有關(guān)。常見(jiàn)的突變類(lèi)型在不同種族之間的差異很大［16］。對(duì)于GBA疾病的研究，通常是選取目標(biāo)人群中突變頻率較高的基因位點(diǎn)進(jìn)行分析。GBA基因突變類(lèi)型目前已報(bào)道有400多種，其中N188S、F213I、D409H、L444P是中國(guó)人群突變頻率較高的4個(gè)GBA 基因位點(diǎn)［14,15］。

本研究從NCBI上獲得戈謝病GBA基因的序列，結(jié)合文獻(xiàn)記載的高突變頻率基因位點(diǎn)，設(shè)計(jì)上下游引物，通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)及毛細(xì)管電泳，獲得GBA基因上述4個(gè)位點(diǎn)的基因分型。結(jié)果顯示，本研究中建立的多重?zé)晒馄畏治龇椒軌蚩焖儆行У貜幕驅(qū)用嬖\斷出受檢者GBA基因的主要4個(gè)位點(diǎn)分型，從而為戈謝病的基因診斷提供參考依據(jù)。通過(guò)該方法的建立，可為日后開(kāi)展的產(chǎn)前篩查、遺傳咨詢(xún)等提供便利，也為后期我國(guó)各地區(qū)開(kāi)展罕見(jiàn)病的優(yōu)生優(yōu)育工作提供支持。

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