感染性疾病學(xué)、傳染病學(xué)

肺炎克雷伯菌攜帶碳青霉烯酶KPC-2的基因環(huán)境的多態(tài)性研究

沈平華，仉英，蔣曉飛

摘要：目的：KPC（Klebsiella pneumoniaecarbapenemases）是導(dǎo)致肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類耐藥的主要原因，而KPC-2是KPC中最常見的類型之一。中國地區(qū)已經(jīng)報道的關(guān)于KPC-2的耐藥基因分別位于肺炎克雷伯菌中的pKP048和pKPHS2質(zhì)粒上，通過對質(zhì)粒全基因測序發(fā)現(xiàn)了兩種攜帶blaKPC-2的基因環(huán)境：pKP048（GenBank accession no：FJ628167.2）的耐藥基因位于一個完整的Tn1721樣轉(zhuǎn)座子中；pKPHS2（GenBank accession no：CP003224.1）上的基因環(huán)境為Tn1721-blaKPC-2-△Tn3-IS26樣的新結(jié)構(gòu)，即Tn1721結(jié)構(gòu)被IS26在Tn3的tnpR處打斷，造成tnpATn3和IRL2Tn1721的丟失。blaKPC-2的基因環(huán)境是了解blaKPC-2播散途徑的重要信息，是進(jìn)行有效的院感控制的基礎(chǔ)。本研究將華山醫(yī)院自第一株碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌檢出到該耐藥細(xì)菌廣泛播散的這段時期內(nèi)耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌作為一個完整的樣本，運(yùn)用PCR及測序獲得攜帶blaKPC-2的完整的基因結(jié)構(gòu)及側(cè)翼序列，希望為下一步深入研究該耐藥基因的播散機(jī)制提供全面的基因背景。方法：收集華山醫(yī)院自2006年8月—2009年12月連續(xù)不重復(fù)的耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌，共42株。運(yùn)用引物KPC-FOR：5'-TCGCTAAACTCGAACAGG-3'和KPCREV：5'-TTACTGCCCGTTGACGCCCAATCC-3'，以抽提的質(zhì)粒為模板，對42株細(xì)菌進(jìn)行blaKPC-2篩選。隨后進(jìn)行多位點(diǎn)序列分型（MLST）。根據(jù)pKP048和pKPHS2的序列，設(shè)計(jì)了一系列PCR引物進(jìn)行擴(kuò)增與測序，分別用于檢測本批菌株中是否存在與上述已經(jīng)報道的blaKPC-2的基因環(huán)境相同的結(jié)構(gòu)。結(jié)合后續(xù)的crossing PCR可以覆蓋整個基因環(huán)境的序列。PCR陽性產(chǎn)物送上海邁浦生物科技有限公司純化后測序。根據(jù)Junction PCR與Mapping PCR的結(jié)果，當(dāng)出現(xiàn)區(qū)別與以上兩種結(jié)構(gòu)的新結(jié)構(gòu)時，擬運(yùn)用代表性質(zhì)粒測序及以純質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR walking等方法，獲得整個新結(jié)構(gòu)的完整基因環(huán)境的序列。結(jié)果：42株肺炎克雷伯菌MLST分型顯示：5株屬于ST423，2株屬于ST65，1株屬于ST977，34株均屬于ST11型。展示了所有菌株攜帶blaKPC-2的基因結(jié)構(gòu)及該結(jié)構(gòu)兩側(cè)的序列。本批菌株檢測到了與pKP048和pKPHS2不同的blaKPC-2的基因環(huán)境。A型為Tn1721-blaKPC-2-Tn3樣結(jié)構(gòu)，顯示具備與pKP048相似的blaKPC-2的基因環(huán)境，但該機(jī)構(gòu)上下游序列分別為parA基因和DNA distortion protein 3-like基因，而不是Tn1721的IRL2。A型結(jié)構(gòu)，分別位于ST423、ST65、ST97型菌株中。B結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒均位于ST11型菌株中。B1型顯示具有與pKPHS2相同的blaKPC-2的基因環(huán)境，即Tn1721-blaKPC-2-△Tn3-IS26。且該結(jié)構(gòu)外圍也具備相同的基因結(jié)構(gòu)。B2型與B1型相比唯一的區(qū)別是J1陰性，以純質(zhì)粒為模板，運(yùn)用引物2R向一側(cè)Walking。該型Tn1721的IRR上游序列與K.pneumoniaJM45 plasmid p2（GenBank accession no：CP006658.1）上的一個功能未知的蛋白序列高度一致，與△IS26無相似性。B2與B1結(jié)構(gòu)中IS26的下游均連接著TniA基因。結(jié)論：華山醫(yī)院自碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌爆發(fā)初期，即存在blaKPC-2基因環(huán)境的多態(tài)性，提示其blaKPC-2播散可能存在不同的來源。尤其B1與B2存在不同的側(cè)翼序列，推測該結(jié)構(gòu)是一種新型的嵌合型可移動元件，可能具備水平轉(zhuǎn)移的能力，轉(zhuǎn)移過程中發(fā)生了不同位置的插入。本文在研究方法上也有一定的創(chuàng)新?？朔诉\(yùn)用全質(zhì)粒測序后獲得攜帶blaKPC-2基因環(huán)境費(fèi)時費(fèi)力及難以進(jìn)行大樣本分析的弊端；同時以往的研究中，通常只是分析blaKPC-2上下游的一小段序列，完整展示了攜帶blaKPC-2基因環(huán)境，為進(jìn)一步分析該結(jié)構(gòu)可能的移動模式和機(jī)制提供了有價值的基因背景。鑒于本文的局限性，下一步擬在菌株收集的時間和種類上進(jìn)一步擴(kuò)展，以獲得華山醫(yī)院耐碳青霉烯類腸桿菌科細(xì)菌攜帶blaKPC-2的基因環(huán)境，為控制醫(yī)院感染提供有價值的信息?？傊A山醫(yī)院耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌的主要流行株為ST11型，且臨床數(shù)據(jù)顯示攜帶耐藥基因blaKPC-2的基因環(huán)境存在多態(tài)性，提出該耐藥基因的水平播散可能存在不同的機(jī)制，為下一步研究該耐藥基因的水平播散模式和機(jī)制奠定了研究基礎(chǔ)。

來源出版物：中國感染與化療雜志, 2016, 16(6): 680-684

入選年份：2016

發(fā)熱門診血流感染154例病原學(xué)分析

李曉光，胥婕，姚貝

摘要：目的：通過分析發(fā)熱門診血流感染患者常見病原菌的分布和藥敏情況，為社區(qū)獲得性血流感染（BSI）的經(jīng)驗(yàn)性治療提供依據(jù)。方法：通過檢索北京大學(xué)第三醫(yī)院檢驗(yàn)系統(tǒng)中2009年1月—2013年12月發(fā)熱門診的血培養(yǎng)化驗(yàn)單，對血培養(yǎng)陽性結(jié)果逐一人工查閱病歷。對臨床考慮為一次感染過程中多次血培養(yǎng)陽性且為同一細(xì)菌者只收錄首次血培養(yǎng)結(jié)果，對于同一患者血培養(yǎng)為多種細(xì)菌者，分析為致病菌或污染菌的可能性后再納入。血流感染的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《2001年中華人民共和國衛(wèi)生部醫(yī)院感染診斷標(biāo)準(zhǔn)（試行）》。污染菌的判定參考美國CDC 1996年醫(yī)院感染診斷標(biāo)準(zhǔn)，常見的皮膚寄殖菌如類白喉?xiàng)U菌、桿菌屬、丙酸桿菌屬、凝固酶陰性葡萄球菌、微球菌考慮污染菌可能。對于凝固酶陰性葡萄球菌，如果在培養(yǎng)72 h以上報警或者單次培養(yǎng)陽性者不計(jì)入統(tǒng)計(jì)。最終154例患者納入研究，分析其病原學(xué)特點(diǎn)。結(jié)果：2009年1月—2013年12月發(fā)熱門診就診患者中1267例行血培養(yǎng)檢查，166例患者培養(yǎng)出菌株177株，9株為重復(fù)培養(yǎng)，1例患者同時培養(yǎng)出大腸埃希菌和表皮葡萄球菌，1例患者同時培養(yǎng)出大腸埃希菌和芽孢桿菌，考慮表皮葡萄球菌和芽孢桿菌為污染菌。結(jié)合血培養(yǎng)報警時間大于72 h和培養(yǎng)出的菌種，另確定12株污染菌，包括葡萄球菌、棒狀桿菌、芽孢桿菌，故實(shí)際納入研究菌株154株（12.2%，154/1267）。154例患者中，男80例（51.9%），女74例（48.1%）?；颊叩钠骄挲g（57±20）歲，65歲以上為老年組有68例（44.2%，68/154）。與中青年組比較，老年組患者中男性比例更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝4.701，P＝0.030）。有明確感染灶者68.2%，主要為肺部感染、急性腎盂腎炎、腸道感染、膽道感染、腹腔感染、肝膿腫等，多部位感染10例（6.0%）。血培養(yǎng)結(jié)果最終納入研究病原菌154株，其中革蘭陰性菌127株（82.5%），革蘭陽性菌27株（17.5%）。革蘭陰性菌的報警時間（time to positivity）：需氧培養(yǎng)（13.8±15.6）h，厭氧培養(yǎng)（13.3±16.2）h；革蘭陽性菌的報警時間：需氧培養(yǎng)（16.9±9.5）h，厭氧培養(yǎng)（17.6±18.9）h；2種菌的報警時間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。大腸埃希菌的報警時間，需氧培養(yǎng)（14.9±14.3）h，厭氧培養(yǎng)（15.6±17.7）h。檢出病原菌第一位是大腸埃希菌82株（53.3%），其次是肺炎克雷伯菌19株（12.3%）、沙門菌屬15株（9.7%）、鏈球菌屬13株（8.4%）、凝固酶陰性葡萄球菌8株（5.2%）。大腸埃希菌對碳青霉烯類藥物敏感率100%，對哌拉西林-他唑巴坦、頭孢哌酮-舒巴坦的敏感率80%以上，對頭孢他啶、頭孢吡肟、氨曲南的敏感率在60%～79%，對頭孢呋辛、頭孢曲松、左氧氟沙星的敏感率50%～60%。分析臨床經(jīng)驗(yàn)治療，病原菌對首選藥物89.2%呈現(xiàn)敏感。結(jié)論：發(fā)熱門診社區(qū)獲得性血流感染患者病原菌種類多樣，以革蘭陰性菌為主，第一位是大腸埃希菌；對多數(shù)患者而言，第三代頭孢菌素、喹諾酮類藥物經(jīng)驗(yàn)治療有效。

來源出版物：中國感染與化療雜志, 2016, 16(2): 123-128

入選年份：2016