七氟烷對大鼠近期空間回憶能力、海馬APOE、Aβ表達(dá)的影響*

徐珊，朱昭瓊，王義，唐春春，張超

（1.遵義醫(yī)學(xué)院 貴州省麻醉與器官保護(hù)基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563000；2.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 麻醉科，貴州 遵義 563003）

近年來，術(shù)后認(rèn)知功能障礙（postoperative cognitive dysfunction，POCD）發(fā)病機(jī)制的研究主要集中在類阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD）途徑。AD核心病理改變是β淀粉樣蛋白（amyloid β，Aβ）沉積，其形成、沉積、降解、啟動并貫穿AD的整個(gè)病理過程[1]。研究證實(shí)，吸入麻醉藥七氟烷可導(dǎo)致海馬Aβ沉積并損害大鼠學(xué)習(xí)記憶能力[2]。Aβ由淀粉樣前體蛋白（Amyloid precusor protein，APP）經(jīng)β、γ分泌酶連續(xù)作用后產(chǎn)生，多因素參與該過程，其中載脂蛋白（apolipoprotein E，APOE）基因多態(tài)性可導(dǎo)致APP異常降解，大量Aβ沉積，進(jìn)一步損害生物膜和破壞細(xì)胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)定[3]。本實(shí)驗(yàn)通過觀察七氟烷麻醉后大鼠行為學(xué)改變及海馬APOE、Aβ變化，揭示七氟烷對成年大鼠近期空間回憶能力和海馬Aβ表達(dá)的影響及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要儀器、試劑

MT-200型Morris水迷宮測試儀（成都泰盟科技有限公司），F(xiàn)abius麻醉機(jī)、Vamos氣體監(jiān)護(hù)儀（德國Drager公司），吸入型七氟烷（臨沂魯南貝特制藥有限公司，批號65150103），Aβ抗體（美國Abcam公司），APOE抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司），GTVisionTM Ⅲ抗鼠/兔通用型免疫組織化學(xué)檢測試劑盒（上?；蚩萍加邢薰荆?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)動物及分組

健康成年SPF級雄性SD大鼠54只，體重300 g左右，由第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，許可證號：SCXK（渝）2012～0005。采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為七氟烷麻醉組、運(yùn)載氣體組、空白對照組，每組18只。在模型復(fù)制后第1天（T1）、第3天（T3）和第7天（T7）取腦組織，采用免疫組織化學(xué)法檢測海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)、DG區(qū)APOE、Aβ的平均光密度值（mean optical density，MOD）。

1.3 麻醉模型的復(fù)制

自制有機(jī)玻璃吸入麻醉箱，規(guī)格75 cm×30 cm×15 cm，兩端側(cè)孔經(jīng)螺紋管與麻醉機(jī)相連，氣體監(jiān)護(hù)儀經(jīng)側(cè)孔監(jiān)測箱內(nèi)七氟烷濃度。箱底鋪2 cm厚鈉石灰。麻醉前1 d將實(shí)驗(yàn)大鼠置于麻醉箱內(nèi)，讓其自由活動15min，以熟悉麻醉箱內(nèi)的環(huán)境，防止麻醉初期出現(xiàn)驚恐不安。七氟烷麻醉組吸入3.2%七氟烷+運(yùn)載氣體（1 L/min 氧氣O2+1 L/min空氣）2 h，運(yùn)載氣體組吸入運(yùn)載氣體2 h，空白對照組自然飼養(yǎng)。觀察并記錄模型復(fù)制過程中大鼠呼吸頻率、皮膚、黏膜顏色。

1.4 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)

Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)包括適應(yīng)性訓(xùn)練1 d、定位航行實(shí)驗(yàn)5 d、空間探索實(shí)驗(yàn)1 d。適應(yīng)性訓(xùn)練排除游泳障礙的大鼠。定位航行實(shí)驗(yàn)：將大鼠面向盆壁，依次從4個(gè)象限中點(diǎn)置入水中，記錄從入水到登上平臺時(shí)間（逃避潛伏期）、游泳距離，時(shí)限120 s，在規(guī)定時(shí)限內(nèi)未找到平臺則記錄120 s，并將大鼠引至平臺停留10 s。空間探索實(shí)驗(yàn)：撤去平臺，以平臺對側(cè)象限作為入水點(diǎn)，時(shí)限120 s，記錄穿越原平臺次數(shù)、進(jìn)入原平臺象限次數(shù)、原平臺象限滯留時(shí)間、原平臺象限滯留時(shí)間百分比。水溫（25±1）℃，平臺置于水面下2 cm，水中混入奶粉隱蔽平臺，每天上午10:00測試。各組大鼠于模型復(fù)制前、取材前行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)。

1.5 免疫組織化學(xué)法

腹腔注射1%戊巴比妥鈉（50 mg/kg），冰盤上取腦組織，4%多聚甲醛固定、石蠟包埋（暴露海馬冠狀面）、切片厚3μm。免疫組織化學(xué)SP法檢測Aβ、APOE的表達(dá)，切片脫蠟、脫水，高壓修復(fù)暴露抗原，一抗（Aβ抗體1∶200稀釋，APOE抗體1∶100稀釋）、二抗依次結(jié)合，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，鏡檢、封片、拍攝圖像。應(yīng)用Image-Pro Plus系統(tǒng)分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，逃避潛伏期的比較，采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)的方差分析（Mauchly球形檢驗(yàn)，P＜0.10時(shí)，校正F值），空間探索實(shí)驗(yàn)和生化指標(biāo)的比較，采用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 模型復(fù)制前各組大鼠逃避潛伏期比較

模型復(fù)制前行定位航行實(shí)驗(yàn)，各組大鼠逃避潛伏期隨訓(xùn)練天數(shù)增加逐漸縮短（T1：F=9.815，P=0.001；T3：F=33.071，P=0.000；T7：F=14.943，P=0.000）。空白對照組、運(yùn)載氣體組和七氟烷麻醉組逃避潛伏期比較，經(jīng)方差分析，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（T1：F=0.771，P=0.631；T3：F=0.779，P=0.624；T7：F=1.394，P=0.242）。見表 1 和圖 1。

2.2 模型復(fù)制前各組大鼠空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

模型復(fù)制前空間探索實(shí)驗(yàn)中，各組穿越原平臺次數(shù)、進(jìn)入原平臺象限次數(shù)、穿越原平臺象限時(shí)間及穿越原平臺象限時(shí)間百分比比較，經(jīng)方差分析，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表 2。

2.3 模型復(fù)制后各組大鼠空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

模型復(fù)制后，比較T1、T3、T7時(shí)間點(diǎn)各組 空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果，穿越原平臺次數(shù)、進(jìn)入原平臺象限次數(shù)、穿越原平臺象限時(shí)間及穿越原平臺象限 時(shí)間百分比比較，經(jīng)方差分析，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

2.4 大鼠海馬各區(qū)Aβ表達(dá)情況比較

T1、T3時(shí)間點(diǎn)各組大鼠海馬各區(qū)Aβ表達(dá)水平比較，經(jīng)方差分析，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。T7時(shí)間點(diǎn)各組大鼠海馬各區(qū)Aβ表達(dá)水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，T7時(shí)間點(diǎn)運(yùn)載氣體組海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)、DG區(qū)Aβ的MOD值與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與運(yùn)載氣體組比較，T7時(shí)間點(diǎn)七氟烷麻醉組大鼠海馬各區(qū)Aβ的MOD值增高（P＜0.05）。見圖 2和表 4。

2.5 大鼠海馬各區(qū)APOE表達(dá)情況比較

T1、T3時(shí)間點(diǎn)各組大鼠海馬各區(qū)Aβ表達(dá)水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。T7時(shí)間點(diǎn)各組大鼠海馬各區(qū)Aβ表達(dá)水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，T1、T3時(shí)間點(diǎn)運(yùn)載氣體組大鼠海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)、DG區(qū)APOE的MOD值與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與運(yùn)載氣體組比較，T1、T3時(shí)間點(diǎn)七氟烷麻醉組大鼠海馬各區(qū)APOE的MOD值降低（P＜0.05）。見圖3和表5。

表1 模型復(fù)制前各組大鼠逃避潛伏期比較 （n =6，s，±s）

表1 模型復(fù)制前各組大鼠逃避潛伏期比較 （n =6，s，±s）

空白對照組 46.89±20.86 20.78±17.91 20.96±7.68 11.84±4.42 10.00±6.29運(yùn)載氣體組 56.13±31.51 29.56±18.49 11.60±6.07 8.69±4.68 8.49±4.74

圖1 各組大鼠逃避潛伏期比較

表2 模型復(fù)制前各組大鼠空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較 （n =6，±s）

表2 模型復(fù)制前各組大鼠空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較 （n =6，±s）

?

表3 模型復(fù)制后各組大鼠空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較 （n =6，±s）

表3 模型復(fù)制后各組大鼠空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較 （n =6，±s）

空白對照組 4±2 23±9 27.21±8.18 23.17±6.96運(yùn)載氣體組 4±2 22±6 26.04±7.7 22.15±6.55七氟烷麻醉組 5±1 27±5 33.67±5.77 26.88±1.68 F值 0.582 1.105 1.908 1.188

圖2 七氟烷麻醉組和運(yùn)載氣體組大鼠海馬Aβ的表達(dá)（×40）

表4 各組大鼠海馬各區(qū)Aβ的MOD值比較（n =6，±s）

表4 各組大鼠海馬各區(qū)Aβ的MOD值比較（n =6，±s）

空白對照組 0.17±0.02 0.17±0.02 0.17±0.02運(yùn)載氣體組 0.17±0.01 0.17±0.02 0.17±0.02七氟烷麻醉組 0.19±0.02 0.19±0.02 0.20±0.02 F值 8.828 4.907 14.381

圖3 七氟烷麻醉組與運(yùn)載氣體組海馬APOE的表達(dá)（×40）

表5 各組大鼠海馬APOE的MOD值比較（n =6，±s）

表5 各組大鼠海馬APOE的MOD值比較（n =6，±s）

空白對照組 0.17±0.03 0.18±0.02 0.19±0.02運(yùn)載氣體組 0.18±0.04 0.19±0.03 0.21±0.04七氟烷麻醉組 0.17±0.02 0.19±0.02 0.22±0.03 F值 0.906 1.119 3.052

3 討論

POCD主要表現(xiàn)為學(xué)習(xí)記憶能力下降、注意力無法集中[4]，這一術(shù)后常見并發(fā)癥長久以來困擾著麻醉醫(yī)生和患者。新型吸入麻醉藥七 氟烷具有誘導(dǎo)迅速、蘇醒快、麻醉過程平穩(wěn)等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于臨床。基礎(chǔ)研究表明，吸入麻醉藥可致嚙齒類動物學(xué)習(xí)記憶能力改變[5-6]，但具體機(jī)制未完全闡明。

成年大鼠最低肺泡有效濃度（minimum alveolar concentration，MAC）為2.4%[7]，七氟烷99%有效劑量為1.3 MAC[8]，本實(shí)驗(yàn)?zāi)M臨床，采用3.2%七氟烷復(fù)制吸入麻醉模型。為避免純氧對本實(shí)驗(yàn)的干擾，采用1 L/min O2+1 L/min空氣作為運(yùn)載氣體并設(shè)立空白對照組。模型復(fù)制后空白對照組與運(yùn)載氣體組的穿越原平臺次數(shù)、進(jìn)入原平臺象限次數(shù)、原平臺象限滯留時(shí)間、原平臺象限滯留時(shí)間百分比，以及海馬Aβ、APOE的MOD值無差異，排除運(yùn)載氣體對本實(shí)驗(yàn)的干擾，實(shí)驗(yàn)結(jié)果真實(shí)可靠。

各組大鼠模型復(fù)制前逃避潛伏期隨著訓(xùn)練天數(shù)增加逐漸縮短，各組大鼠組間比較無差異?？臻g探索實(shí)驗(yàn)中，各組穿越原平臺象限次數(shù)、進(jìn)入原平臺象限時(shí)間、原平臺象限滯留時(shí)間及原平臺象限滯留時(shí)間百分比無差異，說明模型復(fù)制前大鼠建立了穩(wěn)定的學(xué)習(xí)記憶能力，且各組大鼠空間探索及回憶探究能力無差異，基線一致。

模型復(fù)制后，七氟烷麻醉組大鼠穿越原平臺次數(shù)、進(jìn)入原平臺象限次數(shù)、原平臺象限滯留時(shí)間及原平臺象限滯留時(shí)間百分比與運(yùn)載氣體組比較無差異，提示臨床常用濃度七氟烷不會損害成年大鼠近期空間聯(lián)想與回憶探究能力，推測臨床工作中近期POCD的發(fā)生與患者年齡、疾病、手術(shù)等因素關(guān)系更大，而吸入麻醉藥七氟烷不是近期POCD發(fā)生的主要危險(xiǎn)因素。

吸入七氟烷后第1天、第3天海馬各區(qū)APOE表達(dá)下降，Aβ無明顯變化；模型復(fù)制后第7天海馬各區(qū)APOE表達(dá)正常，Aβ增高。由此可見，APOE與Aβ變化趨勢一致，低水平的APOE將Aβ維持在正常水平，T7時(shí)間點(diǎn)APOE恢復(fù)正常時(shí)Aβ出現(xiàn)沉積。APOE并非Aβ生成的唯一相關(guān)因素。大量研究證實(shí)，早老蛋白、乙酰膽堿等與Aβ變化有關(guān)[9-10]。由此推測，七氟烷可能經(jīng)其他途徑引起海馬Aβ增加，同時(shí)下調(diào)APOE表達(dá)，抑制海馬Aβ沉積，使Aβ總體水平維持在正常范圍。然而，這種作用存在一定時(shí)限性，術(shù)后第7天是Aβ增加的關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)，應(yīng)警惕七氟烷損害成年大鼠遠(yuǎn)期空間回憶能力。

綜上所述，3.2%七氟烷不會引起術(shù)后早期成年大鼠海馬各區(qū)Aβ沉積，該作用是通過下調(diào)APOE表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的；吸入七氟烷后第7天是海馬各區(qū)Aβ增加的關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)，但此時(shí)尚未能引起大鼠空間回憶能力損害。

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