肺損傷的干細胞治療

張琦，帥訓軍，侯念果，艾登斌*

（1泰山醫(yī)學院研究生處，泰安，271000；2山東省青島市市立醫(yī)院麻醉科，山東省青島市臨床麻醉研究中心，青島，266000）

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）/急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）（ALI/ARDS）起病之初由肺局部或遠隔組織損傷引起，臨床屢見繼發(fā)于嚴重的反應性肺炎、敗血癥、有毒劑吸入、急性胰腺炎、多發(fā)性創(chuàng)傷及大量輸血等。ALI/ARDS患者肺組織局部炎性介質（如炎性因子、趨化因子、蛋白酶、活性氧物質、細胞凋亡激活劑和抑制劑激活的活性氧自由基）的釋放，肺部充斥促炎性細胞因子及嗜中性粒細胞。促炎性細胞因子囊括有：趨化因子配體-1（chemokine ligands-1，CXCL-1）、趨化因子配體-2（chemokine ligands-2, CXCL-2）、白細胞介素-6（interleukin , IL-6）、干擾素，白細胞介素-6和細胞間黏附分子-1和腫瘤壞死因子 -α（tumor necrosis factor, TNF-α）[1]；嗜中性粒細胞依賴性組織損傷是ALI/ARDS的主要病因：嗜中性粒細胞聚積于肺組織將機械性阻塞肺毛細血管床，終至微循環(huán)障礙。再者，其代謝產生過量活性氧物質（reactive oxygen species, ROS）和含氮物質如氧自由基、NO等，通過它們的氧化劑系統(tǒng)生成吞噬細胞煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，進一步產生氧化酶和一氧化氮合酶（nitric oxide synthase,NOS），摧毀肺泡毛細血管屏障、提高滲透性，結果導致富含蛋白質的液體滲入肺泡腔和間質組織，引發(fā)非心源性肺水腫。截至目前，研究表明ALI/ARDS小鼠肺中髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）活性增加，MPO酶是檢驗嗜中性粒細胞的滲透活動能力的金標準。以上綜合作用，最終引起肺組織病理生理學改變內容包括：彌漫性肺泡上皮損傷、肺泡 - 毛細血管膜分解、失去完整性、肺泡毛細血管通透性增加，鑒于以上因素的協(xié)同作用，結果蛋白質流體不可逆性滲入肺泡。

ALI / ARDS患者多表現(xiàn)有：急性發(fā)作性呼吸急促、高熱、心動過速和呼吸困難，疾病不可逆性的進展至極端情況下，出現(xiàn)難治性呼吸衰竭、多器官功能衰竭及并發(fā)其他基礎疾病。目前的治療方案僅局限于基礎醫(yī)療護理和支持性通氣策略[2]等對癥治療，尚無法逆轉疾病進程、提高患者生活質量及降低病死率。經動物實驗研究發(fā)現(xiàn)，人臍帶MSC（human umbilical cord mesenchymal stem cells，UCMSC）的道德問題很少、治療效果確切可靠，進而給廣大臨床治療及實驗研究工作者帶來新的曙光，目前正致力于評估其潛在的臨床應用價值：外周移植干細胞，其主動、趨化性定植于動物受損局部組織，主動分化出成熟組織細胞以彌補、修繕損傷組織結構；分泌促生長因子以促進受損細胞修復再生；分泌抗炎因子從而抑制細胞炎癥反應；分泌抗菌性細胞微生物肽成分直接在肺組織的局部發(fā)揮殺滅細菌作用；除此之外，干細胞還釋放參與調節(jié)適應性、先天性免疫的細胞因子、調節(jié)肺內皮和上皮細胞等細胞膜通透性的細胞因子。至此，我們對于干細胞治療肺損傷的具體作用機制知之甚少，鑒于研究人員不懈努力的付出，干細胞治療肺損傷的課題引起國內外學者的高度重視，由此成為業(yè)界學者重點研究的方向。

1 間充質干細胞治療肺損傷

治療ALI/ARDS核心步驟是要實現(xiàn)肺結構重建、功能修復以及恢復正常的氣體交換。間充質干細胞（mesenchymal stem cells, MSCs）作為骨髓動員細胞中最豐富的儲存細胞，在肺部具有協(xié)助受傷組織的修復和引導細胞新生、與此同時激活肺組織自我修復的潛力、改善肺組織局部微循環(huán)進而重建肺泡氣體交換[3]。干細胞免疫原性極低，規(guī)避了道德爭議；其來源廣泛、提取及制備方法簡單[4],研究已證實經靜脈、咽及氣管內接種干細胞，減輕LPS、博來霉素、肺部撞擊以及高氧等誘導的鼠ALI/ARDS[5,6]，注射MSCs后鼠肺膠原沉積和纖維化程度明顯減輕[7]，接著檢測抗炎性細胞因子得出∶白介素-10（interleukin-10，IL-10）的表達水平急劇增加。MSCs是由多能干細胞所衍生的、能夠持續(xù)自我更新的原始細胞，其具有前瞻性的修復ALI/ARDS鼠肺損傷細胞，在受損局部刺激組織再生，研究結果揭示其降低促纖維化因子表達水平，如轉化生長因子 -α（transforming growth factor-α, TGF-α）、I-型膠原（ collagen-I, Col-I）和III型膠原纖維（ collagen-III, Col-III）表達明顯下降，結果抑制了肺部纖維化進展。

研究表明骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）對ALI/ARDS的保護作用主要涉及以下幾個方面：外周輸注BMSCs后，其將主動性歸巢至受損傷的肺組織[8]，減輕局部炎癥性損傷[9-10]，促進內皮細胞修復及恢復免疫功能不協(xié)調[11]，移植肺中的MSCs具有自我更新和分化為間充質細胞的能力。眾所周知，標準的MSCs具有成骨、脂肪生成和軟骨成骨的體外能力[12]，其發(fā)揮治療ALI/ARDS的作用機制包括：線粒體之間的DNA的傳輸和其他胞質成份通過細胞間橋梁，可以調節(jié)受體細胞的細胞生物學功能[13]，干細胞通過外分泌IL-10、IL-RN、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF）、血管生成素-1（angiogenin-1）作為ALI/ARDS中氣體-血管屏障上的抗炎和預處理介質[14-16]。干細胞分泌微囊泡（microvesicle，MV），包含具有治療作用及修復損傷的潛力的mRNA和miRNA[17-19]。BMSCs保護大腸桿菌誘導的鼠ALI/ARDS、削弱全身性氧化應激反應[20]，在體外ALI/ARDS模型中，BMSCs恢復鈉離子輸送、保存肺泡上皮通透性進而幫助重建肺上皮結構[21]，減輕炎癥、提升細菌性肺炎中的細菌清除率[22]。

2 間充質干細胞修復肺損傷時受神經內分泌免疫網絡的影響

ALI/ARDS的病因影響MSCs的修復效率和再生方式，前人關于鼠ALI/ARDS的干細胞治療的研究揭示了時間肺重建效率、功能修復過程快慢取決于制模時的誘導因素如活細菌、油酸、熒光素、病毒及真菌等[23]，其次神經內分泌免疫網絡的一致性原則對修復損傷肺產生的影響表現(xiàn)為：受傷的肺部釋放大量與壓力有關的神經內分泌激素、神經調節(jié)因子和神經肽，對MSCs的生物活性產生深遠影響[24-26]，越來越多的證據表明糖皮質激素、腎上腺素和去甲腎上腺素可能參與MSCs動員期間的細胞遷移和活化過程[27]。MSCs再生和修復肺的機制很復雜，我們在強調受體神經內分泌免疫網絡微環(huán)境調控MSCs作用的同時，患者免疫狀態(tài)的保護功效也與MSCs減輕小鼠的肺損傷有關，由此可見，神經內分泌的協(xié)調免疫網絡對肺修復和再生非常重要。外源性MSCs修復肺損傷及再生肺細胞的優(yōu)勢作用與鼠被接種多細胞數量成正相關[28]。在使用MSCs治療ALI/ARDS的過程中不可避免的要仔細考慮其潛在的污染性、生物安全性等問題帶來的隱患。一旦細胞接種完成后，這些MSCs在受體內周轉率也進一步提高，仍需注意控制降低移植相關免疫排斥反應和畸胎瘤形成的風險[29-31]。

3 間充質干細胞的年齡及來源對其修復能力的影響

MSCs衍生的MV在組織細胞分化中發(fā)揮重要抑制作用，其激活、調節(jié)性產生新的T細胞及在體外促進干擾素-γ（IFN-γ）釋放，刺激分泌抗炎性細胞因子（白介素（IL）-10和轉化生長因子（TGF-α），表明MSCs衍生的MV是治療相關的免疫調節(jié)試劑。外源性MSCs的突出優(yōu)勢即在于其相對高安全性、可及性，只需要合理使用激活原件即可實施MSCs在骨髓、血液和肺中的動員以及再分配。另外，還有其他針對MSCs的重要發(fā)現(xiàn)及相應研究報道，有學者稱發(fā)現(xiàn)一些從骨髓、胎盤和臍帶血提取的、具有免疫性能的MSCs與受著體內T細胞產生差異性對抗。由此可見，影響免疫排斥反應強弱的因素，首先需考慮MSCs供體年齡和受體接種方式；其次同一物種之間接種MSCs的治療效果優(yōu)于不同物種，而相同物種之間接種MSCs，自體移植治療效果優(yōu)于異體移植[32,33]；老化的MSCs顯示出低下的遷移能力，易被受體免疫性T細胞殺傷，因此得出患者自體幼稚的MSCs是實現(xiàn)精準治療的首選[34]。

4 間充質干細胞的接種途徑對其修復能力的影響及“人造肺”模型

接種MSCs的途徑也影響MSCs發(fā)揮治療作用的功效，合理地移植接種途徑如靜脈、氣管、胸膜內以及腹膜內等為較理想的接種途徑。通過腹膜內給于鼠MSCs治療胺碘酮誘導的鼠ALI/ARDS中，其治療效果遠遠落后于靜脈內接種途徑[35]。眾多臨床工作者對受傷的肺組織修復的研究進行到目前為止，幾乎沒有發(fā)現(xiàn)健康供體肺用于移植。鑒于此事實，最近有學者們提出生物“人造肺”模型。業(yè)內學者們致力于尋找接種MSCs的高效途徑的同時，研究運用胎肺細胞培育出成熟肺結構，以構建可以完全取代受損肺組織的生物“人造肺”。但由于生物肺復雜的三維組織結構和40多種細胞類型，結果限制了實驗人員完美的構建出生物肺模型。雖然生物“人造肺”具有重要的研究利用價值，可能為嚴重ALI/ARDS患者提供替代治療措施，并將使陽光照射全球5000萬終末期ALI/ARDS患者，但不可規(guī)避的困難在于涉及其基質的完整性的問題如氣體交換能力有限等還有待解決。

肺的內源性重塑、修復和再生已經成為難治性肺部疾病的重點治療途徑，大多數成功的ALI/ARDS治療實驗，使用的是嚙齒動物模型來完成[36]。動物肺在胸腔內增加個體生命周期的能力與人類是完全不同的，內源性、外源性MSCs移植到成熟的人類肺組織中必然要克服免疫排斥反應帶來的困難；其次，目前實驗研究重點僅在于低排斥性的人角膜上皮細胞（ human corneal epithelial stem cell，HCEC），其他類型干細胞治療作用的研究技術尚不成熟、干細胞研究領域仍有全新領域待開發(fā)。研究數據表明，通過KGF、HGF和類視色素酸等調節(jié)劑可以安全有效的實現(xiàn)MSCs的自我更新、增殖、遷移和分化，有學者提出內源性及外源性MSCs組合治療，利用互補治療作用，可能提高ALI/ARDS臨床療效[37,38]。

5 肺泡II型上皮細胞治療肺損傷的機制

誘導多能干細胞（pluripotent stem cells, iPSC）分化出來的肺泡上皮細胞（alveolar epithelial cells,AECs）代表了肺組織工程和細胞療法為肺損傷研究者提供了新機會。在前人研究中，通過修改胚胎干細胞的培養(yǎng)方案，獲得了表面活性蛋白C（surfactant protein C, SPC）以及肺泡上皮II型細胞（alveolar type II epithelial cells，AEC II）。分化后的iPSC顯示出與AEC II細胞相似的形態(tài)學特征。當分化的iPSC接種并在去細胞化的小鼠肺支架中培養(yǎng)時，細胞重新形成肺泡結構并表達SPC或T1α蛋白（分別為AEC II或AEC I細胞的標記）。分化的iPSC經氣管滴入博來霉素誘導的小鼠急性肺損傷模型。分化后的iPSC移植后可以觀察到顯著減少的鼠肺部炎癥和膠原沉積的降低。分化的iPSC顯示出再生三維肺泡肺結構的潛力，并可用于消除肺損傷。

6 肺損傷治療的局限及未來希望

目前針對肺損傷的治療藥物，僅僅只能穩(wěn)定患者病情或延緩疾病進展，無法從根源上恢復受損的肺功能。雖然肺移植是這些肺疾病進展至晚期的唯一明確選擇，但供體器官短缺是一個主要問題。組織工程以及再生醫(yī)學是用于交換受損細胞或組織與新功能細胞或組織的新的多學科領域。終末期肺病的再生醫(yī)學的最關鍵一步是：誘導干細胞生成包含兩種細胞類型的肺泡上皮細胞即肺泡上皮I型和II型細胞（AEC I和AEC II）。 AEC II細胞在肺損傷的前提下已經顯示出經歷增殖和分化為AEC I細胞以修復損傷的肺泡上皮的功能，但這種修復過程通常導致肺結構的不適當重建。多能細胞中的胚胎干細胞（ESCs）具有自我更新能力，可在體外分化成肺泡上皮細胞，但免疫排斥和倫理問題限制了胚胎干細胞的臨床應用。通過引入幾種確定的、從分化的體細胞中獲得的轉錄因子誘導iPSCs，其表現(xiàn)出與ESC相似的自我更新特性和多能性。另外，它們有可能克服上述ESCs的限制性問題。這些細胞可以在三維培養(yǎng)物中使脫細胞的小鼠肺支架再細胞化。這些分化的細胞植入鼠肺后改善了肺損傷。

盡管如此，我們對未來的展望和最后的發(fā)展方向仍抱有強烈的信心：干細胞療法為修復嚴重的急性和慢性肺損傷拓寬了研究空間和領域。盡管一些研究已經證明了骨髓干細胞在嚙齒動物肺損傷模型中的治療潛力，但沒有直接臨床證據表明這些干細胞在人體內能填充肺泡上皮細胞。廣大學者在看到曙光的同時，需要投入更多精力鉆研。