尖銳濕疣組織中Bad和增殖細(xì)胞核抗原蛋白表達(dá)的檢測

夏仙仙，蔡丙杰，沙 珂，潘信心，尹光文

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科 鄭州 450052

1 對象與方法

1.1研究對象CA標(biāo)本均來自2015年9月至2016年9月鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科門診，患者臨床表現(xiàn)典型，醋酸白實驗為陽性，皮損經(jīng)組織病理證實為CA，原位雜交證明HPV感染存在，均與CA的診斷標(biāo)準(zhǔn)相符合，且無其他系統(tǒng)性疾??；皮損取材前患者均未接受免疫性的藥物、冷凍、激光等任何相關(guān)治療；共收集53例CA患者組織標(biāo)本，其中男32例，女21例；年齡16～65(32.5±8.7)歲；病程14～180(50.7±4.3) d。28例對照組標(biāo)本均來自同期本院泌尿科成年男性包皮環(huán)切術(shù)后所切除的包皮組織，并經(jīng)組織病理查證實其為正常組織上皮。

1.2試劑與方法所有實驗組織標(biāo)本經(jīng)40 g/L多聚甲醛固定，石蠟包埋，并連續(xù)作0.4 μm厚度切片，然后將其覆于用多聚賴氨酸處理過的玻片上，置于60 ℃烤箱烘烤4 h以上備用。兔抗人Bad多克隆抗體(濃縮型)購自武漢Proteintech公司，兔抗人PCNA多克隆抗體(濃縮型)購自Abcam公司，SP-9001試劑盒、DAB顯色試劑盒購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。采用免疫組化SP法檢測所有標(biāo)本中Bad和PCNA蛋白的表達(dá)情況。所有實驗操作步驟都按試劑盒上的說明進(jìn)行。在相同條件，所有切片染色，且每批染色均設(shè)陽性對照、陰性對照。用已知染色陽性的組織切片為陽性對照，陰性對照以PBS代替一抗孵育組織切片。

1.3結(jié)果判斷Bad蛋白陽性表達(dá)主要處于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，陽性顯色為棕黃色至棕褐色顆粒。PCNA蛋白陽性表達(dá)定位于細(xì)胞核，棕黃色或棕褐色顆粒為陽性染色。參照文獻(xiàn)[1]評分標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)組織切片中染色強弱及陽性細(xì)胞所占總細(xì)胞百分比進(jìn)行分級評分。染色強度分為不著色、淺黃色、棕黃色及棕褐色，分別對應(yīng)著0分、1分、2分和3分；陽性細(xì)胞占總細(xì)胞的百分比≤10%：0分，11%～：1分，26%～：2分，51%～：3分，≥76%：4分；將上述兩項分值的乘積作為最終結(jié)果，0分：陰性(-)，1～4分：弱陽性(+)，5～8分，陽性()，9～12分：強陽性()。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 17.0進(jìn)行分析，應(yīng)用秩和檢驗比較CA組織和正常包皮組織中Bad、PCNA蛋白表達(dá)的差異，應(yīng)用列聯(lián)系數(shù)分析CA組織中Bad和PCNA蛋白表達(dá)的關(guān)聯(lián)性，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1CA組織和正常包皮組織中Bad蛋白的表達(dá)

見圖1、表1。Bad陽性表達(dá)主要處于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，陽性為棕黃色至棕褐色，大多數(shù)呈灶狀或者片狀并分布于棘細(xì)胞層中下部。53例CA組織中Bad蛋白陽性表達(dá)37例，其陽性表達(dá)率為69.8%，陽性表達(dá)強度多為～；28例對照組中Bad出現(xiàn)陽性表達(dá)有8例，其陽性表達(dá)率28.6%(8/28)，陽性表達(dá)強度多呈-～+。PCNA蛋白陽性表達(dá)主要位于細(xì)胞核，陽性顯色呈棕黃色或棕褐色，位于表皮的基底細(xì)胞層、棘細(xì)胞層、甚至顆粒層，為散在性或者彌漫性分布。53例CA組織中PCNA蛋白的陽性表達(dá)46例，其陽性表達(dá)率為86.8%，陽性表達(dá)強度大多數(shù)呈～；28例對照組中PCNA蛋白的陽性表達(dá)11例，其陽性表達(dá)率39.3%(11/28)，陽性表達(dá)強度多為+～。

A：Bad蛋白；B：PCNA蛋白；1：CA組織；2：正常包皮組織圖1 CA組織和正常包皮組織中Bad、PCNA蛋白的表達(dá)(SP，×400)

例

2.2CA組織中Bad和PCNA蛋白表達(dá)的關(guān)聯(lián)性

見表2。列聯(lián)系數(shù)分析發(fā)現(xiàn)Bad與PCNA在CA組織中的表達(dá)不相關(guān)(rP=0.134,P=0.325)。

表2 CA組織中Bad和PCNA蛋白表達(dá)的關(guān)聯(lián)性分析 例

3 討論

Bad是Bcl-2家族中經(jīng)典的促凋亡蛋白成員之一，具有BH3同源結(jié)構(gòu)域和序列，在人類正常組織細(xì)胞中均有陽性表達(dá)，乳腺、結(jié)腸、脾內(nèi)以及睪丸等中出現(xiàn)較高水平的穩(wěn)定表達(dá)[2]。生理狀態(tài)下，磷酸化的Bad與14-3-3蛋白相結(jié)合，當(dāng)?shù)蛲鱿嚓P(guān)信號刺激后，可誘導(dǎo)Bad表達(dá)水平升高或去磷酸化增強，通過易位和一些細(xì)胞活動來促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生凋亡[3]。當(dāng)多種激酶作用于Bad時，可使Bad多個絲氨酸殘基發(fā)生磷酸化，在某些因素下磷酸化的Bad處于無活性狀態(tài)，從而使細(xì)胞減少或免于凋亡[4-5]。研究[6-7]表明，Bad在多種疾病中的陽性表達(dá)有著重要的意義。本實驗結(jié)果顯示，53例CA組織中有37例Bad陽性表達(dá)，而在28例正常包皮組織中只有8例Bad陽性表達(dá)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，表明CA組織中存在Bad的過表達(dá)，這種過表達(dá)提示Bad在一定程度上促進(jìn)CA組織中角質(zhì)形成細(xì)胞的凋亡，可能是HPV病毒感染后Bad在多種因素影響下，通過酪氨酸激酶途徑激活細(xì)胞凋亡，從而一定程度上抑制CA組織細(xì)胞的異常增殖。但機體受到相關(guān)刺激或者某些激素的影響后，Bad發(fā)生磷酸化[8-11]，磷酸化Bad失去活性或者與其他成員結(jié)合形成復(fù)合物，發(fā)揮細(xì)胞抗亡的作用，間接促進(jìn)CA組織細(xì)胞的過度增生。促凋亡蛋白Bad在CA組織中出現(xiàn)高水平的陽性表達(dá)，也提示Bad的表達(dá)過程受到其他相關(guān)因子或者激素的調(diào)控，但其具體機制不清楚，有待于進(jìn)一步的研究。

PCNA為DNA聚合酶的一種輔酶，參與細(xì)胞異常增殖過程中DNA復(fù)制和細(xì)胞周期調(diào)控[12]，其表達(dá)程度和含量能夠準(zhǔn)確地反映細(xì)胞的增殖狀態(tài)和生長速度情況，是細(xì)胞增殖狀態(tài)的理想標(biāo)記物。因此，PCNA是目前普遍公認(rèn)的腫瘤細(xì)胞S期的一種標(biāo)志物，已被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞異常增生的實驗研究。本研究結(jié)果顯示，在正常上皮組織中，PCNA陽性表達(dá)率為39.3%，其陽性表達(dá)大部分在具有增殖、分化能力的基底細(xì)胞層及其附近細(xì)胞；而在CA患者組織中，PCNA陽性表達(dá)率高達(dá)86.8%，其陽性表達(dá)除在具有分化能力的基底細(xì)胞層外，分化相對良好的棘細(xì)胞層、甚至顆粒層中也出現(xiàn)PCNA的陽性表達(dá)，并且PCNA在CA組織中的陽性表達(dá)率和陽性表達(dá)強度均高于正常對照組，這與國內(nèi)的一些研究[13]結(jié)果一致，其原因可能是HPV可以活化PCNA基因，HPV-DNA和HPV某些基因產(chǎn)物刺激PCNA在宿主細(xì)胞中出現(xiàn)過度表達(dá)，促進(jìn)CA組織中表皮上層的細(xì)胞也增殖活躍，同時高表達(dá)的PCNA可以為受病毒感染的細(xì)胞復(fù)制提供所需要的大量元件，調(diào)節(jié)細(xì)胞由靜止期轉(zhuǎn)化為增殖期，導(dǎo)致HPV在棘層的上部細(xì)胞內(nèi)順利地進(jìn)行DNA復(fù)制，促使細(xì)胞中染色體也進(jìn)行了大量的復(fù)制，從而導(dǎo)致棘細(xì)胞層甚至顆粒層細(xì)胞過度的異常增殖。

本實驗結(jié)果顯示，在CA組織中Bad和PCNA的陽性表達(dá)無明顯相關(guān)性，提示CA疾病的形成受到多種基因的調(diào)控，促凋亡蛋白Bad、PCNA及某些相關(guān)基因共同參CA的發(fā)生、發(fā)展，但其確切機制仍需進(jìn)一步研究。

[1] BUCKLE MA,PAHEMIK SA,SURER A,et al.Inhibition of the alphavintegrin with a cyclin RGD peptide impairs angiogenesis,growth and metastasis of solid tumors in vivo[J].Br J Cancer,2002,86(5):788

[2] 黃娜,李為民.Bad與腫瘤關(guān)系的研究[J].華西醫(yī)學(xué),2011,26(11):1747

[3] DANIAL NN.BAD:undertaker by night,candyman by day[J].Oncogene,2008, 27(Suppl 1):S53

[4] YAMAMOTO T,KAMBE F,CAO X,et al.Parathyroid hormone activates phosphoinositide 3-kinase-Akt-Bad cascade in osteoblast-like cells[J].Bone,2007, 40(2):354

[5] LAUSSON S,CRESSENT M.Signal transduction pathways mediating the effect of adrenomedullin on osteoblast survival[J].J Cell Biochem,2011,112(12):3807

[6] 張福萍,宋祥晨,陳玉婷,等.牙齦蛋白酶誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡中促凋亡蛋白Bad的表達(dá)改變[J].中華老年口腔醫(yī)學(xué)雜志,2013,11(5):257

[7] 李闖,鐘勇,葉勁.促凋亡基因Bad在腫瘤細(xì)胞凋亡中的作用及進(jìn)展[J].湖北民族學(xué)院學(xué)報,2013,30(1):70

[8] HAYAKAWA J, OHMICHI M, KURACHI H,et al. Inhibition of BAD phosphory lation either at serine 136 via AKT cascade sensitizes human ovarian cancer cell to cisplation[J].Cancer Res,2000,60(1):5988

[9] HARADA H, ANDERSEN JS, MANN M,et al.p70s6 kinase signals cell survival as well as growth,inactivating the pro-apoptotic molecule BAD[J]. Proc Natl Acad Sci USA,2001,98(17):9666

[10]FUJITA N1, SATO S, TSURUO T.Phosphorylation of p27Kipl at threonine 198 by p90 ribosomal protein S6 kinase promotes its binding to 14-3-3 and cytoplasmic localization[J].J Biol Chem,2003,278(49):49254

[11]ZHOU XM, LIU Ym, PAYNE G,et al.Growth factors inactivate the cell death promoter BAD by phosphorylation of its BH3 domain on ser155[J].J Biol Chem,2000,275(32):25046

[12]ACHARYA N,KLASSEN R,JOHNSON RE,et al.PCNA binding domains in all three subunits of yeast DNA polymerase δ modulate its function in DNA replication[J].Proc Natl Acad Sci USA,2011,108(44):17927

[13]趙衛(wèi)華,黃小躍,解士海,等.Livin和PCNA在尖銳濕疣組織中的表達(dá)及意義[J].皮膚性病診療雜志,2012,19(1):25