過敏性鼻炎患者外周血嗜酸性粒細(xì)胞富集群中IL-18、IL-18BP和IL-18R的表達(dá)

崔夫波，柴文戍，張慧云，王君靈，胡雅琳，王 玲，何韶衡

1)錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院變態(tài)反應(yīng)與臨床免疫研究中心 遼寧錦州 121001 2)錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科 遼寧錦州 121001 3)蘇州市相城人民醫(yī)院中心實(shí)驗室 江蘇蘇州 215100

據(jù)報道[1]中國大陸人口過敏性鼻炎(allergic rhinitis，AR)的患病率為4%～38%，全球患病率為10%～25%，且20%～30%的AR患者常伴哮喘。AR作為一種常見病、多發(fā)病，影響著患者的生活質(zhì)量和人類健康[2]。AR發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，人們曾提出Th1/Th2/Th17/Treg細(xì)胞模式學(xué)說[3]，認(rèn)為機(jī)體高表達(dá)Th2細(xì)胞因子，進(jìn)而誘導(dǎo)IgE生成、增強(qiáng)氣道嗜酸性粒細(xì)胞浸潤和提高氣道反應(yīng)性等是AR的重要原因[4]。IL-18作為炎癥因子可調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡，廣泛參與包括鼻炎、哮喘等過敏性疾病[5-7]。研究[6,8]表明，AR患者血清IL-18水平升高。IL-18結(jié)合蛋白(IL-18 binding protein，IL-18BP)作為IL-18的天然抑制劑，可通過中和IL-18而抑制IL-18與IL-18受體(IL-18R)結(jié)合[9-10]，進(jìn)而降低表達(dá)IL-18R的效應(yīng)細(xì)胞(Th1、Th2和Th17等)的功能。有報道[4]稱，AR患者用過敏原鼻腔激發(fā)4～6 h后，可出現(xiàn)以鼻塞為主并伴有鼻黏膜內(nèi)嗜酸性粒細(xì)胞浸潤和活化的遲發(fā)相反應(yīng)，提示過敏原和嗜酸性粒細(xì)胞參與AR發(fā)病。本研究旨在用流式細(xì)胞儀檢測AR患者外周血經(jīng)過敏原刺激前后嗜酸性粒細(xì)胞富集群中IL-18、IL-18BP和IL-18R的表達(dá)情況，希望為以后IL-18、IL-18BP和IL-18R與嗜酸性粒細(xì)胞的相關(guān)研究提供方向。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗材料PE/Cy7-CD14抗體、PerCP-CD16抗體、死細(xì)胞去除染料、BV510-驢抗兔IgG、FcR阻斷劑、紅細(xì)胞裂解液、布雷非德菌素A(BFA)購自Biolegend公司(美國)，PE-IL-18、APC-IL-18R購自R&D Systems公司(美國)，兔抗人IL-18BP購自Abcam公司(英國)，蒿草花粉提取液、塵螨提取液和梧桐花粉提取液購自北京新華聯(lián)協(xié)和藥業(yè)有限責(zé)任公司(中國)，PBS購自Solarbio公司(美國)，Cytofix/CytopermTM固定/透膜試劑盒購自BD Biosciences Pharmigen公司(美國)，皮膚點(diǎn)刺試驗過敏原購自ALK-ABELLO公司(丹麥)，其他常用化學(xué)試劑均為分析純。低溫高速離心機(jī)(美國Thermo Scientific公司)，水浴鍋(中國精宏公司)，F(xiàn)ACSVerse流式細(xì)胞儀(美國BD Biosciences公司)。

1.2研究對象和樣本采集募集AR急性發(fā)作期入院患者和體檢健康者(正常對照組)為志愿者。30位志愿者的一般資料見表1。AR的診斷標(biāo)準(zhǔn)符合2015年美國耳鼻咽喉頭頸外科學(xué)會專家組發(fā)布的過敏性鼻炎臨床實(shí)踐指南[11]。AR患者均處于急性發(fā)作期，且至少2周前停止服用治療鼻炎的藥物。所有志愿者至少一個月內(nèi)未發(fā)生過呼吸道感染。本研究獲得了錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)，并與志愿者均簽訂了知情同意書。每位志愿者采集10 mL外周靜脈血于含EDTA抗凝劑的采血管中待測。

表1 30例志愿者的一般資料

年齡、病史和發(fā)病年齡均為中位數(shù)(極小值～極大值)

1.3血液嗜酸性粒細(xì)胞富集群中IL-18、IL-18BP和IL-18R的表達(dá)全血分成4份，分別加入BFA、塵螨、蒿草花粉或梧桐花粉過敏原粗提液(質(zhì)量濃度為1.0 mg/L)，37 ℃水浴振蕩孵育1 h；1 400 r/min離心后棄去上清，加入死細(xì)胞去除染料與FcR阻斷劑，均勻混合后，避光孵育15 min，然后加入抗CD14、CD16和IL-18R抗體，避光孵育15 min后裂解紅細(xì)胞，離心后用固定/透膜液固定細(xì)胞，然后加入抗IL-18和抗IL-18BP抗體孵育，透膜洗液清洗后加入BV510-驢抗兔IgG，最后上流式細(xì)胞儀檢測嗜酸性粒細(xì)胞富集群中IL-18+、IL-18BP+和IL-18R+細(xì)胞比例及平均熒光強(qiáng)度(MFI)。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理用SPSS 13.0處理數(shù)據(jù)。采用k個相關(guān)樣本的秩和檢驗分析過敏原刺激前后正常對照組或AR組以上指標(biāo)的差異，采用秩和檢驗比較2組刺激前以上指標(biāo)的差異，用秩相關(guān)系數(shù)分析AR組IL-18BP+細(xì)胞和IL-18+細(xì)胞MFI的關(guān)系，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 2組IL-18+、IL-18BP+和IL-18R+細(xì)胞比例及MFI的比較見表2、3。激發(fā)前，與正常對照組比較，AR患者嗜酸性粒細(xì)胞富集群中IL-18+細(xì)胞比例無變化，但I(xiàn)L-18BP+和IL-18R+細(xì)胞比例分別是正常對照組的1.879倍和1.698倍。梧桐花粉粗提液刺激后AR患者外周血IL-18+細(xì)胞比例升高約33%。正常對照組激發(fā)前后，外周血嗜酸性粒細(xì)胞富集群中IL-18+、IL-18BP+和IL-18R+細(xì)胞比例和MFI差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。

表2 2組嗜酸性粒細(xì)胞富集群中IL-18+、IL-18BP+和IL-18R+細(xì)胞比例的比較 %

#: 與正常對照組激發(fā)前相比，P<0.05；*:與AR組激發(fā)前相比，P<0.05

表3 2組嗜酸性粒細(xì)胞富集群中IL-18+、IL-18BP+和IL-18R+細(xì)胞MFI的比較

2.2AR患者IL-18BP+細(xì)胞和IL-18+細(xì)胞MFI的關(guān)系A(chǔ)R患者嗜酸性粒細(xì)胞富集群中IL-18BP+細(xì)胞和IL-18+細(xì)胞MFI高度相關(guān)(rS=0.783，P<0.001)。

3 討論

大量的研究[12-13]認(rèn)為IL-18可協(xié)同IL-12抑制Th2細(xì)胞的增殖，減少Th2細(xì)胞釋放炎癥遞質(zhì)，從而抑制氣道炎癥。也有研究[5,8]表明IL-18可促進(jìn)特異性IgE生成及誘導(dǎo)Th2細(xì)胞分泌Th2細(xì)胞因子(如IL-4、IL-5和IL-13等)，且其血液水平隨過敏性疾病炎癥程度的加重有增高的趨勢。本研究結(jié)果顯示，AR患者外周血嗜酸性粒細(xì)胞富集群中IL-18+細(xì)胞比例與正常對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義，然而經(jīng)梧桐花粉過敏原刺激后IL-18+細(xì)胞比例升高約33%，提示梧桐花粉過敏原可能誘導(dǎo)了嗜酸性粒細(xì)胞釋放IL-18。

IL-18通過與細(xì)胞表面的IL-18R相互作用在機(jī)體防御及致病過程中發(fā)揮其生物學(xué)功能。哮喘兒童肺組織中嗜酸性粒細(xì)胞升高并伴有IL-18R表達(dá)增加[14]。之前的研究[7]發(fā)現(xiàn)OVA致敏鼠腹腔注射IL-18后可誘導(dǎo)小鼠腹腔灌注液中肥大細(xì)胞IL-18R表達(dá)上調(diào)。以上研究提示嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞表面的IL-18R可能在過敏性疾病中起重要作用。本研究結(jié)果顯示AR患者外周血嗜酸性粒細(xì)胞富集群中IL-18R的表達(dá)約為正常對照組的1.7倍，進(jìn)一步提示嗜酸性粒細(xì)胞表面的IL-18R可能在AR中起重要作用。

IL-18可與IL-18BP結(jié)合而降低IL-18BP的生物學(xué)活性，目前人們對IL-18BP的抗炎作用進(jìn)行了廣泛研究[9-10,15-16]。我們的研究發(fā)現(xiàn)AR患者嗜酸性粒細(xì)胞富集群中IL-18BP+細(xì)胞約為正常對照組的1.8倍。有研究[10]顯示，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞中IL-18與IL-18BP的表達(dá)高度相關(guān)。本研究結(jié)果顯示AR患者嗜酸性粒細(xì)胞群中IL-18BP+細(xì)胞MFI和IL-18+細(xì)胞MFI高度相關(guān)，提示IL-18BP可能通過正反饋機(jī)制中和IL-18進(jìn)而抑制AR發(fā)病。

綜上所述，嗜酸性粒細(xì)胞源的IL-18、IL-18BP和IL-18R可能在AR中起重要作用，IL-18、IL-18BP及IL-18R可能是治療AR的潛在靶點(diǎn)。

[1] ZHANG Y,ZHANG L.Prevalence of allergic rhinitis in China[J].Allergy Asthma Immunol Res,2014,6(2):105

[2] BOUSQUET J,SCHüNEMANN HJ,SAMOLINSKI B,et al.Allergic Rhinitis and its Impact on Asthma(ARIA): achievements in 10 years and future needs[J].J Allergy Clin Immunol,2012,130(5):1049

[3] MILNER JD.IL-17 producing cells in host defense and atopy[J].Curr Opin Immunol,2011,23(6):784

[4] ELIASHAR R,LEVI-SCHAFFER F.The role of the eosinophil in nasal diseases[J].Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg,2005,13(3):171

[5] KRUSE S,KUEHR J,MOSELER M,et al.Polymorphisms in the IL 18 gene are associated with specific sensitization to common allergens and allergic rhinitis[J].J Allergy Clin Immunol,2003,111(1):117

[6] SANDERS NL,MISHRA A.Role of interleukin-18 in the pathophysiology of allergic diseases[J].Cytokine Growth Factor Rev,2016,32:31

[7] WANG J,ZHANG H,ZHENG W,et al.Correlation of IL-18 with tryptase in atopic asthma and induction of mast cell accumulation by IL-18[J].Mediators Inflamm,2016,2016:4743176

[8] VERHAEGHE B,GEVAERT P,HOLTAPPELS G,et al.Up-regulation of IL-18 in allergic rhinitis[J].Allergy,2002,57(9):825

[9] MAROTTE H,AHMED S,RUTH JH,et al.Blocking ERK-1/2 reduces tumor necrosis factor alpha-induced interleukin-18 bioactivity in rheumatoid arthritis synovial fibroblasts by induction of interleukin-18 binding protein A[J].Arthritis Rheum,2010,62(3):722

[10]MAROTTE H,TSOU PS,RABQUER BJ,et al.Blocking of interferon regulatory factor 1 reduces tumor necrosis factor α-induced interleukin-18 bioactivity in rheumatoid arthritis synovial fibroblasts by induction of interleukin-18 binding protein a:role of the nuclear interferon regulatory factor 1-NF-κB-C-jun complex[J].Arthritis Rheum,2011,63(11):3253

[11]SEIDMAN MD,GURGEL RK,LIN SY,et al.Clinical practice guideline:allergic rhinitis[J].Otolaryngol Head Neck Surg,2015,152(1 Suppl):S1

[12]ARIANO R,MERENDINO RA,MINCIULLO PL,et al.Specific immunotherapy effect on interleukin-18 and CD30 serum levels in monosensitized patients with rhinitis[J].Allergy Asthma Proc,2003,24(3):179

[13]DINARELLO CA,NOVICK D,KIM S,et al.Interleukin-18 and IL-18 binding protein[J].Front Immunol,2013,4:289

[14]ODA H,KAWAYAMA T,IMAOKA H,et al.Interleukin-18 expression, CD8(+) T cells, and eosinophils in lungs of nonsmokers with fatal asthma[J].Ann Allergy Asthma Immunol,2014,112(1):23

[15]BANDA NK,VONDRACEK A,KRAUS D,et al.Mechanisms of inhibition of collagen-induced arthritis by murine IL-18 binding protein[J].J Immunol,2003,170(4):2100

[16]KIM SH,EISENSTEIN M,REZNIKOV L,et al.Structural requirements of six naturally occurring isoforms of the IL-18 binding protein to inhibit IL-18[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2000,97(3):1190