四氫嘧啶對凝乳酶熱穩(wěn)定性的影響

武彬+石天虹+劉雪蘭+閻佩佩+井慶川

摘要：為研究四氫嘧啶對凝乳酶熱穩(wěn)定性的影響，向凝乳酶溶液中加入0.175～5.600 mmol/L的四氫嘧啶，測定不同濃度四氫嘧啶對凝乳酶活力的影響；之后測定了含0.50～2.00 mmol/L四氫嘧啶的凝乳酶溶液在69℃保溫不同時間后的凝乳酶活力，將熱保溫后的酶溶液在4℃復(fù)性36 h，并再次測定酶活力的變化。結(jié)果顯示，不同濃度四氫嘧啶對凝乳酶活力影響不大，各組酶活力均降低8.2%左右；加入四氫嘧啶會顯著降低凝乳酶的熱穩(wěn)定性，但會發(fā)生明顯的復(fù)性作用，提示四氫嘧啶可能具有維持部分失活態(tài)凝乳酶穩(wěn)定性的作用。

關(guān)鍵詞：四氫嘧啶；凝乳酶；熱穩(wěn)定性；復(fù)性作用

中圖分類號：S879.1文獻(xiàn)標(biāo)識號：A文章編號：1001-4942（2018）01-0131-04

Abstract To study the effect of ectoine on the thermostability of rennin， 0.175～5.600 mmol/L ectoine were added into rennin solution to determine the effects of ectoine concentration on rennin activity， and then the rennin solutions added 0.50～2.00 mmol/L ectoine were heated in water bath at 69℃ for different time， and renaturated at 4℃ for 36 hours. The changes of rennin activities after water-bath and renaturation were both determined. The results showed that different concentrations of ectoine had little effects on rennin activity， and the rennin activity decreased by about 8.2%.When ectoine was added into rennin solution， the thermostability of rennin decreased and renaturation would significantly happened， which indicated that ectoine might be essential for keeping the stability of partial inactivated rennin.

Keywords Ectoine； Rennin； Thermostability； Renaturation

凝乳酶是制作乳酪和干酪素必需的酶制劑，能水解牛奶中κ-酪蛋白的Phe105-Met106肽鍵，使牛奶凝結(jié)，經(jīng)過一系列加工過程后制成乳酪[1]。醫(yī)學(xué)研究結(jié)果表明，凝乳酶還具有治療兒童消化不良的臨床作用[2]。凝乳酶與其他酶制劑一樣，在生產(chǎn)和應(yīng)用中，高熱、凍融、輻射、有機(jī)溶劑等都可能使酶變性失活，導(dǎo)致酶活力損失。乳酪加工對凝乳酶的添加量有嚴(yán)格的要求[3]，而作為藥品制劑也要求凝乳酶能夠保持較高的穩(wěn)定性。固定化、化學(xué)修飾和蛋白質(zhì)工程等方法都能夠提高酶制劑的熱穩(wěn)定性，而添加糖類、多元醇、聚合物等穩(wěn)定劑的方法適用范圍廣，作用效果較好，得到了廣泛應(yīng)用。

Ectoine（1，4，5，6-四氫-2-甲基-4-嘧啶羧酸，簡稱四氫嘧啶）是Galinski等[4]發(fā)現(xiàn)的在耐鹽微生物中所廣泛含有的一種滲透壓補償性溶質(zhì)，具有穩(wěn)定天然蛋白質(zhì)水化層，保護(hù)酶和DNA等生物大分子和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，提高其穩(wěn)定性等作用。四氫嘧啶能夠提高中性蛋白酶、脂肪酶、超氧化物歧化酶、糖化酶、植酸酶等酶制劑的熱穩(wěn)定性，其最佳使用濃度相差很大。魏勝華等發(fā)現(xiàn)提高中性蛋白酶熱穩(wěn)定性的四氫嘧啶最佳添加濃度為5.0 mmol/L，可使該酶殘余活力提高51.8%[5]；王越等研究表明，四氫嘧啶提高脂肪酶熱穩(wěn)定性的最佳濃度為1.5 mmol/L[6]。李強(qiáng)等報道對于超氧化物歧化酶，四氫嘧啶濃度在0.1～0.7 mmol/L對其熱穩(wěn)定性的作用效果最佳[7]。酶的熱失活是溫度和時間復(fù)合作用的結(jié)果，但大部分研究在測定酶的熱穩(wěn)定性時，多選取固定保溫時間，沒有跟蹤酶活力隨保溫時間變化的情況。

目前，關(guān)于穩(wěn)定劑對酶的保護(hù)機(jī)理多是在海藻糖的研究結(jié)果上提出的玻璃態(tài)假說、水替代假說和優(yōu)先排阻假說[8]，關(guān)于四氫嘧啶對酶的保護(hù)機(jī)理研究不多。本試驗主要研究了四氫嘧啶對凝乳酶熱穩(wěn)定性的影響，研究結(jié)果有助于增強(qiáng)四氫嘧啶提高酶制劑穩(wěn)定性作用機(jī)理的理解。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

四氫嘧啶購自Sigma公司，純度>98%；凝乳酶購自Sigma公司；脫脂奶粉購自伊利實業(yè)有限公司；其他試劑均為分析純；水為二次去離子水。

1.2 試驗方法

1.2.1 凝乳酶活力測定與相對酶活力計算 凝乳酶活力測定采用Arima法[9]：凝乳酶以0.02 mol/L pH 6.0的磷酸緩沖液稀釋800倍，以此為原液，取0.5 mL，在35℃預(yù)熱5 min，加入到5 mL 35℃預(yù)熱的pH 6.0、含1% CaCl2的10%脫脂牛乳中，計時至管壁出現(xiàn)顆粒，記錄凝乳時間（T）。以35℃ 40 min凝乳1 mL牛乳的酶量為一個酶活力單位（U）。凝乳酶活力及相對活力的計算公式如下：

凝乳酶活力A=5×24000.5×T×n ； （1）

凝乳酶相對活力Ar=ApA0×100% 。 （2）

式中，T為凝乳時間，s；n為稀釋倍數(shù)，本試驗為1；Ap為經(jīng)過各種處理后凝乳酶的殘余活力，U；A0為未經(jīng)任何處理的凝乳酶活力，U。endprint

1.2.2 四氫嘧啶對凝乳酶活力影響的測定 取凝乳酶原液與分別含有0.175、0.350、0.525、0.700、1.050、1.400、2.800、4.200和5.600 mmol/L四氫嘧啶的混合酶液，測定其酶活力，并計算凝乳酶相對活力。

1.2.3 熱失活處理 1.5 mL離心管中加入1.2 mL含有0、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50和2.00 mmol/L四氫嘧啶的凝乳酶溶液，放入69℃水浴并立即開始計時，每分鐘取樣一次，樣品取出后立即轉(zhuǎn)入冰水中快速降溫，然后取0.5 mL酶液測定殘余凝乳酶活力。

1.2.4 復(fù)性處理 將1.2.3中經(jīng)過熱失活處理并降溫的不含四氫嘧啶與含有0.75 mmol/L四氫嘧啶的凝乳酶液轉(zhuǎn)入冰箱4℃靜置36 h后取出，取0.5 mL測定凝乳酶活力，計算相對酶活力，并與1.2.3中結(jié)果進(jìn)行比對。

2 結(jié)果與分析

2.1 四氫嘧啶對凝乳酶活力的影響

凝乳酶通過水解κ-酪蛋白生成副κ-酪蛋白，繼而發(fā)生蛋白質(zhì)膠體聚集并形成化學(xué)鍵而使牛奶凝結(jié)。四氫嘧啶是一種滲透壓補償性溶質(zhì)，能夠與凝乳酶分子表面和內(nèi)部的基團(tuán)結(jié)合，引起凝乳酶分子氫鍵和其他分子間作用力的改變，這可能會影響凝乳酶催化活力的正常發(fā)揮。由圖1看出，加入的四氫嘧啶濃度在0.175～5.600 mmol/L范圍內(nèi)，凝乳酶活力均降低8.2%左右。

2.2 四氫嘧啶對凝乳酶熱穩(wěn)定性的影響

在加入四氫嘧啶后，凝乳酶的熱穩(wěn)定性都有不同程度地降低，四氫嘧啶為0.75 mmol/L時，能測到酶活力的熱處理時間最長，處理7 min相對活力仍保留9%且其相對酶活力也明顯高于其他濃度組；其他濃度保溫4～6 min后，即無法測到酶活力（凝乳時間>600 s，酶活力損失>93.3%）；當(dāng)四氫嘧啶濃度大于2.00 mmol/L時，即使保溫時間為1 min的樣品也無法測到凝乳酶活力（圖2）。

2.3 四氫嘧啶對凝乳酶復(fù)性的作用

試驗結(jié)果表明，不含四氫嘧啶凝乳酶的對照組，在復(fù)性前后酶活力基本保持不變；而含有四氫嘧啶的凝乳酶復(fù)性作用十分顯著。熱處理時間3 min以上時，復(fù)性效果較為顯著，復(fù)性導(dǎo)致的相對酶活力提升保持在10%～15%；熱處理5 min以上，復(fù)性后的含四氫嘧啶的凝乳酶相對酶活力高于不含四氫嘧啶的對照組（圖3）。

3 討論與結(jié)論

魏勝華等認(rèn)為四氫嘧啶能夠改變酶分子的氫鍵締合，增加β-折疊結(jié)構(gòu)，維持酶分子構(gòu)象從而提高酶制劑的熱穩(wěn)定性[5]。然而，四氫嘧啶添加量顯著影響到其對酶的保護(hù)作用，過量的四氫嘧啶會抑制酶活力[6]。Meyer等發(fā)現(xiàn)四氫嘧啶增強(qiáng)了DNA分子從雙螺旋結(jié)構(gòu)向開環(huán)結(jié)構(gòu)的變化[10]，其原因可能是由于大分子所帶電荷對四氫嘧啶的影響。本研究結(jié)果表明，加入0.175～5.600 mmol/L四氫嘧啶后，凝乳酶活力均降低8.2%左右，該結(jié)果與王越報道的四氫嘧啶提高植酸酶熱穩(wěn)定性的結(jié)果截然不同[11]，這可能與凝乳酶和植酸酶分子結(jié)構(gòu)的差別有關(guān)。

目前，二步串聯(lián)失活動力學(xué)模型能夠很好地分析和解釋某些酶的失活過程[12]，模型如下：

ENKEDKiEi 。 （3）

式中，EN為活性態(tài)酶；ED為部分失活態(tài)酶；Ei為完全失活態(tài)酶；K為可逆失活步驟中的平衡常數(shù)；Ki為不可逆失活步驟的失活速率常數(shù)。酶的熱失活過程的發(fā)生分為兩步，首先活性態(tài)的酶EN先可逆失活為部分失活態(tài)酶ED，然后部分失活態(tài)酶ED不可逆失活為完全失活態(tài)酶Ei。

本研究結(jié)果顯示，加入0.50～2.00 mmol/L的四氫嘧啶，都會使凝乳酶的熱穩(wěn)定性顯著降低，其中，四氫嘧啶濃度為0.75 mmol/L時，酶活力降低的最慢。另外，處于部分失活狀態(tài)的凝乳酶在經(jīng)過36 h復(fù)性處理后，酶活力又有一定的回升，熱處理3～7 min復(fù)性作用最為顯著，相對酶活力提升了10%～15%。該結(jié)果可能提示四氫嘧啶具有誘導(dǎo)凝乳酶結(jié)構(gòu)向部分失活態(tài)轉(zhuǎn)變并維持該狀態(tài)保持相對穩(wěn)定的作用。

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