乳酸菌和納豆芽孢桿菌對(duì)黃曲霉毒素B₁和伏馬毒素B₁的吸附作用研究

姜富貴+韓紅+陳雪梅+李祥明+盛清凱

摘要：為了研究乳酸菌和納豆芽孢桿菌對(duì)霉菌毒素的吸附作用，采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，研究不同菌濃度、環(huán)境溫度及吸附時(shí)間對(duì)吸附作用的影響。結(jié)果表明，乳酸菌和納豆芽孢桿菌對(duì)黃曲霉毒素B1和伏馬毒素B1的吸附作用主要受菌濃度的影響（P<0.05），溫度和時(shí)間對(duì)吸附強(qiáng)度無(wú)顯著影響。濃度為1×109 CFU/mL時(shí)，乳酸菌對(duì)黃曲霉毒素B1的吸附強(qiáng)度（18.02%）顯著高于納豆芽孢桿菌（13.88%）（P<0.05），對(duì)伏馬毒素B1的吸附強(qiáng)度（13.45%）顯著低于納豆芽孢桿菌（17.62%）（P<0.05）。建議提高菌群數(shù)量及種類以去除飼料中霉菌毒素的危害。

關(guān)鍵詞：乳酸菌；納豆芽孢桿菌；黃曲霉毒素B1；伏馬毒素B1；吸附作用

中圖分類號(hào)：S182文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2018）01-0127-05

Abstract To investigate the adsorption of Lactobacillus and Bacillus natto on mycotoxin， the L9（34） orthogonal experimental design method was used to study the effects of different bacterial concentrations， environmental temperatures and times on adsorption in this experiment. The results showed that the adsorption of Lactobacillus and Bacillus natto on aflatoxin B1 and fumonision B1 were mainly affected by their concentrations （P<0.05）， but not significantly affected by adsorption time and environmental temperature. The adsorption intensity of Lactobacillus on aflatoxin B1 （18.02%） was higher than that of Bacillus natto （13.88%） at the concentration of 1×109 CFU/mL， whereas that of Lactobacillus on fumonision B1 （13.45%） was lower than that of Bacillus natto （17.62%） （P<0.05）. So increasing the amounts and species of microorganisms should be proposed to reduce the risk of mycotoxin in feed.

Keywords Lactobacillus； Bacillus natto； Aflatoxin B1； Fumonision B1； Adsorption

霉菌毒素是一類在霉菌生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的有毒次級(jí)代謝產(chǎn)物[1]。動(dòng)物飼喂霉菌毒素污染的飼料，會(huì)出現(xiàn)急性或慢性中毒癥狀，包括動(dòng)物生長(zhǎng)受到抑制，飼料利用率降低，動(dòng)物產(chǎn)仔數(shù)、禽類產(chǎn)蛋率和孵化率下降等[2]。發(fā)酵脫毒法對(duì)飼料營(yíng)養(yǎng)成分的損失小，是應(yīng)用前景非常廣闊的一種生物解毒方法，存在微生物吸附作用、酶降解作用以及有機(jī)酸抑制作用三種作用方式[3]，但發(fā)揮生物脫毒主效作用的方式到目前為止仍不清楚。雖然國(guó)家飼料添加劑品種目錄（2013）規(guī)定飼料中可以允許添加的微生物有30多種，但具體哪種微生物的脫毒效果最好也難以判定。因此，本研究選取在飼料中常見(jiàn)且對(duì)動(dòng)物和人影響較大的黃曲霉毒素B1和伏馬毒素B1為研究對(duì)象，探索飼料中常用的乳酸菌和納豆芽孢桿菌對(duì)兩種霉菌毒素的吸附作用，以及環(huán)境溫度和吸附時(shí)間對(duì)吸附作用的影響，旨在為去除飼料中的霉菌毒素提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

乳酸菌（植物乳桿菌）和納豆芽孢桿菌（枯草芽孢桿菌），由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所提供。黃曲霉毒素B1（AFB1）和伏馬毒素B1（FB1），購(gòu)自上海優(yōu)甘生物科技有限公司。AFB1和FB1檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自ROMER國(guó)際貿(mào)易北京有限公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法

試驗(yàn)采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)（詳見(jiàn)表1）。分別取不同濃度菌溶液3 mL放入5 mL離心管中，然后于4℃冷凍離心機(jī)10 000×g離心10 min。棄去上清液，在沉淀的菌泥中加入3 mL滅菌生理鹽水，然后輕輕吹打、混勻。向各離心管中分別加入50 μL霉菌毒素溶液（AFB1濃度為2 μg/mL，F(xiàn)B1濃度為50 μg/mL），混勻，在不同試驗(yàn)溫度和160 r/min振蕩條件下，培養(yǎng)相應(yīng)時(shí)間。試驗(yàn)結(jié)束后，樣品在4℃冷凍離心機(jī)10 000×g離心10 min，取出上清液，采用酶聯(lián)免疫法測(cè)定霉菌毒素量，計(jì)算吸附強(qiáng)度。每試驗(yàn)重復(fù)3次，每次采樣后平行3次測(cè)定。

吸附強(qiáng)度（%）=（1-上清液中霉菌毒素的量/試驗(yàn)前加入量）×100。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SAS 9.1的PROC GLM過(guò)程分析各處理組的吸附強(qiáng)度，采用student-t檢驗(yàn)進(jìn)行比較，使用SAS程序的CORR過(guò)程對(duì)相關(guān)系數(shù)進(jìn)行分析，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌濃度、溫度及時(shí)間對(duì)AFB1吸附強(qiáng)度的影響

由表2可以看出，乳酸菌對(duì)AFB1的吸附強(qiáng)度在不同濃度間有顯著差異（P<0.05），不同溫度間和不同時(shí)間都沒(méi)有顯著差異（P﹥0.05）。乳酸菌濃度越高對(duì)AFB1的吸附強(qiáng)度越大。對(duì)AFB1吸附強(qiáng)度影響最強(qiáng)的因素是乳酸菌濃度，其次是時(shí)間，溫度的影響最小。endprint

2.2 乳酸菌濃度、溫度及時(shí)間對(duì)FB1吸附強(qiáng)度的影響

由表3可以看出，3種濃度乳酸菌對(duì)FB1的吸附有顯著影響（P<0.05），乳酸菌濃度越高對(duì)FB1的吸附強(qiáng)度越大。對(duì)FB1吸附強(qiáng)度影響最強(qiáng)的因素是乳酸菌濃度，其次是溫度和時(shí)間。

2.3 納豆芽孢桿菌濃度、溫度及時(shí)間對(duì)AFB1吸附強(qiáng)度的影響

由表4可以看出，3種濃度納豆芽孢桿菌對(duì)AFB1的吸附有顯著影響（P<0.05），納豆芽孢桿菌濃度越高對(duì)AFB1的吸附強(qiáng)度越大。對(duì)AFB1吸附強(qiáng)度影響最強(qiáng)的因素是納豆芽孢桿菌濃度，其次是時(shí)間和溫度。

2.4 納豆芽孢桿菌濃度、溫度及時(shí)間對(duì)FB1吸附強(qiáng)度的影響

由表5可以看出，3種濃度納豆芽孢桿菌對(duì)FB1的吸附有顯著影響（P<0.05），納豆芽孢桿菌濃度越高對(duì)FB1的吸附強(qiáng)度越大。對(duì)FB1吸附強(qiáng)度影響最強(qiáng)的因素是納豆芽孢桿菌濃度，其次是時(shí)間和溫度。

2.5 兩種菌之間不同影響因素對(duì)不同毒素吸附影響的比較

由表6看出，菌種濃度為1×109 CFU/mL時(shí)，乳酸菌對(duì)AFB1的吸附強(qiáng)度顯著高于納豆芽孢桿菌（P<0.05），對(duì)FB1的吸附強(qiáng)度顯著低于納豆芽孢桿菌（P<0.05）；菌種濃度為1×108、1×107 CFU/mL時(shí)，乳酸菌對(duì)AFB1和FB1的吸附強(qiáng)度均顯著高于納豆芽孢桿菌（P<0.05），表明菌種的吸附與菌種種類和濃度相關(guān)。

由表7看出，乳酸菌和納豆芽孢桿菌之間菌種濃度對(duì)于AFB1、FB1吸附強(qiáng)度k值的相關(guān)系數(shù)都大于0.9900，溫度在0.8941～0.9684，而時(shí)間的相關(guān)系數(shù)最小，表明這兩種菌在同等濃度、同樣溫度的條件下對(duì)同種毒素有相似的吸附，同樣的吸附時(shí)間可能存在差異。

3 討論與結(jié)論

吸附是指物質(zhì)（主要是指固體物質(zhì)）表面吸住周圍介質(zhì)（液體或氣體）中分子或離子的現(xiàn)象。依據(jù)吸附劑與吸附質(zhì)之間作用力的性質(zhì)，吸附可分為物理吸附和化學(xué)吸附。物理吸附不具選擇性，吸附作用力為范德華力，且不受溫度影響；而化學(xué)吸附具選擇性，吸附劑只對(duì)某些吸附質(zhì)產(chǎn)生吸附作用[4]。本試驗(yàn)中乳酸菌和納豆芽孢桿菌對(duì)AFB1、FB1的吸附受溫度影響小，且對(duì)不同霉菌毒素吸附強(qiáng)度不同，推斷乳酸菌和納豆芽孢桿菌的吸附可能以物理吸附為主[5]。微生物細(xì)胞壁主要由甘露聚糖、葡聚糖和蛋白質(zhì)等組成，含有-COOH、-NH2、-SH、-OH等官能團(tuán)，這些物質(zhì)中的氮、氧、硫等原子都可以提供孤對(duì)電子與霉菌毒素配位。目前未見(jiàn)納豆芽孢桿菌對(duì)霉菌毒素的吸附報(bào)道。本試驗(yàn)中乳酸菌吸附AFB1的結(jié)果與Zeng等[6]、Khanafari等[7]和Huang等[8]一致，但與殷傳振[9]結(jié)果不同，原因在于殷傳振[9]是混合菌發(fā)酵處理，非單一菌的吸附試驗(yàn)。本試驗(yàn)乳酸菌吸附對(duì)FB1的吸附結(jié)果與Zhao等[10]和Zhang等[11]相同。乳酸菌、納豆芽孢桿菌吸附霉菌毒素，這可能與微生物吸附重金屬鎘[12]、塑化劑[13]等相似，不同之處在于吸附強(qiáng)度存在差異。

本試驗(yàn)中對(duì)霉菌毒素吸附的主要影響因素為菌種濃度，其次為溫度和時(shí)間，這與馮艷忠[14]結(jié)果相似。本試驗(yàn)結(jié)果顯示乳酸菌和納豆芽孢桿菌這兩種微生物對(duì)AFB1和FB1這兩種霉菌毒素的作用相似，不過(guò)本試驗(yàn)擴(kuò)大了微生物種類和霉菌毒素種類。乳酸菌與納豆芽孢桿菌對(duì)AFB1和FB1吸附強(qiáng)度的差異，可能源自乳酸菌與納豆芽孢桿菌的細(xì)菌表層結(jié)構(gòu)差異[15]以及AFB1、FB1的分子量、結(jié)構(gòu)不同。菌種濃度為1×109 CFU/mL時(shí)乳酸菌對(duì)FB1的吸附強(qiáng)度低于納豆芽孢桿菌，而1×108 CFU/mL時(shí)高于納豆芽孢桿菌，其原因是否與兩種菌的次級(jí)代謝物差異有關(guān)有待研究。

本試驗(yàn)中乳酸菌、納豆芽孢桿菌吸附霉菌毒素，為霉菌毒素脫毒及降解創(chuàng)造了條件。盡管霉菌毒素被吸附后其危害仍然存在[16]，但乳酸菌、納豆芽孢桿菌和蒙脫石等吸附劑[17]一樣有助于霉菌毒素的體外排泄，減緩霉菌污染飼料的毒性。另外納豆芽孢桿菌等的吸附還可能促進(jìn)霉菌毒素與微生物分泌的酶制劑的接觸，有利于霉菌毒素的酶解[18，19]。本試驗(yàn)中乳酸菌對(duì)AFB1的吸附強(qiáng)度為18.02%，低于發(fā)酵飼料的脫毒比例[3]，表明吸附作用在生物脫毒中處于次要、輔助作用，微生物分泌酶的酶解可能為主要作用。飼料發(fā)酵過(guò)程中乳酸菌、納豆芽孢桿菌等擴(kuò)繁，細(xì)菌數(shù)量不斷增加，同時(shí)其分泌的霉菌毒素降解酶含量也同時(shí)增加，吸附和酶解二者之間的共同作用有待進(jìn)一步研究。

參 考 文 獻(xiàn)：

[1] 楊曙明， 張輝. 飼料中有毒有害物質(zhì)的控制與測(cè)定[M]. 北京： 北京農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社， 1994.

[2] 張煥， 王加啟， 高亞男，等. 霉菌毒素對(duì)畜禽的危害及其毒性降解研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)飼料， 2017（4）：12-16.

[3] 王旭哲. 全株玉米青貯發(fā)酵及有氧穩(wěn)定期霉菌毒素動(dòng)態(tài)變化研究[D]. 石河子：石河子大學(xué)， 2016.

[4] 周巖民.飼料毒物的吸附脫毒[C]//中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)2009學(xué)術(shù)年會(huì)論文集（上冊(cè)）.2009.

[5] Haskard C A， El-Nezami H S， Kankaanp P E， et al. Surface binding of aflatoxin B1 by lactic acid bacteria [J]. Appl. Environ. Microbiol.， 2001， 7：3086-3091.

[6] Zeng D， Tang Y R， Xue-Qin N I， et al. Absorption characteristics of Lactobacillus plantarum F22 to aflatoxin B1 [J]. Food Science， 2009， 30（23）：365-369.endprint

[7] Khanafari A， Soudi H， Miraboulfathi M， et al. An in vitro investigation of aflatoxin B1 biological control by Lactobacillus plantarum [J]. Pak. J. Biol. Sci.， 2007， 10（15）：2553-2556.

[8] Huang L， Duan C， Zhao Y， et al. Reduction of aflatoxin B1 toxicity by Lactobacillus plantarum C88： a potential probiotic strain isolated from Chinese traditional fermented food “Tofu” [J]. Plos One， 2017， 12（1）. doi：10.1371/journal.pone.0170109.

[9] 殷傳振. 4種霉菌毒素的吸附和降解效果研究[D]. 泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2015.

[10]Zhao H， Wang X， Zhang J， et al. The mechanism of Lactobacillus strains for their ability to remove fumonisins B1 and B2 [J]. Food & Chemical Toxicology， 2016， 97：40-46.

[11]Zhang J， Qiao Y， Wang X， et al. Absorption of fumonisin B1 and B2 by Lactobacillus plantarum ZJ8 [J]. Acta Microbiologica Sinica， 2014， 54（12）：1481-1488.

[12]熊婧. 乳酸菌對(duì)重金屬鎘的耐受性和吸附機(jī)制研究[D]. 廣州：暨南大學(xué)， 2015.

[13]趙麗麗， 賀新麗， 楊佳越，等. 乳桿菌吸附塑化劑的影響因素分析及效果評(píng)價(jià)[J]. 微生物學(xué)通報(bào)， 2015， 42（6）：1185-1191.

[14]馮艷忠.霉菌毒素對(duì)豬危害及生物降解法研究[M]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2014.

[15]孟珺. 乳桿菌表層蛋白的理化性質(zhì)和生物學(xué)功能研究[D]. 無(wú)錫：江南大學(xué)， 2016.

[16]李志剛， 楊寶蘭， 姚景會(huì)，等. 乳酸菌對(duì)黃曲霉毒素B1吸附作用的研究[J]. 中國(guó)食品衛(wèi)生雜志， 2003， 15（3）：212-215.

[17]梁曉維， 李發(fā)弟， 張軍民，等. 蒙脫石和凹凸棒石對(duì)霉菌毒素吸附性能的研究[J]. 中國(guó)畜牧獸醫(yī)， 2014， 41（11）：133-138.

[18]Wu Y Z， Lu F P， Jiang H L， et al. The furofuran-ring selectivity， hydrogen peroxide- production and low Km value are the three elements for highly effective detoxification of aflatoxin oxidase [J]. Food & Chemical Toxicology， 2015， 76：125-131.

[19]Xu L， Ahmed M F E， Sangare L， et al. Novel aflatoxin-degrading enzyme from Bacillus shackletonii L7 [J]. Toxins，2017，9（1）：36.endprint