平邑甜茶外源花粉授粉效果和生殖機(jī)能研究

高付鳳+毛云飛+張佳騰+楊恒峰+王增輝+沈向

摘要：以平邑甜茶（Malus hupehensis）為母本，用“紅麗”觀賞海棠花粉進(jìn)行人工授粉，設(shè)計(jì)不去雄不授粉不套袋、去雄授粉套袋、套袋花開(kāi)后去雄授粉和去雄不授粉套袋四個(gè)處理，利用物理統(tǒng)計(jì)、顯微觀察、流式細(xì)胞儀等技術(shù)，研究不同授粉處理平邑甜茶坐果率、果實(shí)生理性狀、后代實(shí)生苗雜種率和倍性的差異，進(jìn)一步探索平邑甜茶的生殖機(jī)能，選擇出平邑甜茶雜交率較高的時(shí)期以增加平邑甜茶的雜交率和雜交種子數(shù)，擴(kuò)大選擇范圍，提高育種效率，為育種實(shí)踐提供重要的理論依據(jù)。結(jié)果顯示，經(jīng)授粉處理后，平邑甜茶種子千粒重增加約8.7%；坐果率顯著提高，10月時(shí)相比自然授粉狀態(tài)下提高約10.1%。自然狀態(tài)下平邑甜茶無(wú)融合生殖率約為43.70%，各處理雜交后代實(shí)生苗大部分為三倍體，少數(shù)為二倍體、四倍體、五倍體和非整倍體，且花開(kāi)前去雄授粉套袋處理顯著提高四倍體形成率。綜上所述，人工授粉有助于提高坐果率，促進(jìn)種子形成；平邑甜茶以無(wú)融合生殖為主，同時(shí)也進(jìn)行有性雜交，且花開(kāi)前授粉能顯著提高四倍體形成率。但三倍體后代實(shí)生苗是經(jīng)有性生殖還是無(wú)融合生殖產(chǎn)生，需進(jìn)一步鑒定。

關(guān)鍵詞：平邑甜茶；無(wú)融合生殖；倍性測(cè)定；熒光活性

中圖分類(lèi)號(hào)：S661.4文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2018）01-0023-06

Abstract Malus hupehensis was used as the female parent， and was artificially pollinated the pollen of Hongli ornamental crabapple. Four treatments including no emasculation and pollination with no bagging （T1）， emasculation and pollination with bagging （T2）， emasculation and pollination after flowering with bagging （T3）， emasculation and no pollination with bagging （T4） were conducted to research the differences in fruit setting rate， fruit physiological traits， offspring seedling hybrid rate and ploidy of Malus hupehensis by physical statistics， microscopic observation and flow cytometry. This study was aimed at further exploring the reproductive function of Malus hupehensis， selecting the period for high hybridization rate to increase the hybridization rate and the number of hybrid seeds， expanding the selection range， improving the breeding efficiency and providing important theoretical bases for breeding. The results showed that the seed weight increased by 8.7% after pollination； the fruit setting rate significantly increased by 10.1% compared with the natural pollination in October. The apomixes rate of Malus hupehensis was about 43.70%. Most of the hybrid offspring seedlings of the four treatments were triploid， and the diploid， tetraploid， pentaploid and aneuploidy were less.The tetraploid formation rate increased significantly under emasculation， pollination and bagging before flowering. In conclusion， artificial pollination was benefit for improving the fruit setting rate and promoting the seed formation. Malus hupehensis used apomixes as the main reproductive mode， and also had sexual hybridization.Pollination before flowering significantly increased the tetraploid formation rate. But it needed to be further identified that the reproductive mode of triploid offspring seedlings was sexual reproduction or apomixes.

Keywords Malus hupehensis； Apomixes； Ploidy determination； Fluorescence activityendprint

平邑甜茶（Malus hupehensis）是湖北海棠的一個(gè)變種，具有非常強(qiáng)的無(wú)融合生殖特性和嫁接親和性[1]。平邑甜茶除具無(wú)融合生殖特性外，還可進(jìn)行有性生殖[2]。植物無(wú)融合生殖具有復(fù)雜的發(fā)育過(guò)程，受多位點(diǎn)多基因控制，涉及多種基因之間不同時(shí)空表達(dá)的互作和協(xié)調(diào)抑制[3]，存在多種類(lèi)型的發(fā)育機(jī)制，可認(rèn)為是有性生殖發(fā)育“失調(diào)”或“短路”的結(jié)果[4]。按照胚體發(fā)生途徑的不同可分為二倍體孢子、無(wú)配子和不定胚三種生殖類(lèi)型。無(wú)融合生殖中存在兼性無(wú)融合生殖現(xiàn)象，且常伴隨著多倍體現(xiàn)象，而其同種或相近物種有性繁殖的個(gè)體通常是二倍體[5]。楊峰等[6]用平邑甜茶與B9、M27、M9進(jìn)行雜交，對(duì)后代雜種實(shí)生苗進(jìn)行倍性測(cè)定，發(fā)現(xiàn)控制平邑甜茶無(wú)融合生殖性質(zhì)的基因?yàn)轱@性，既有主效單基因質(zhì)量遺傳，也有多基因數(shù)量遺傳。王穎等[7]用平邑甜茶與扎矮山定子雜交，獲得6株皺葉矮生型株系，相比平邑甜茶其無(wú)融合生殖能力發(fā)生很大程度的退化，而有性生殖能力得到了恢復(fù)。大多數(shù)研究[3，6]是針對(duì)平邑甜茶的無(wú)融合生殖機(jī)理，對(duì)其有性生殖機(jī)理研究甚少，其有性生殖雜交率較高時(shí)期和后代倍性分離狀況尚需探究。因此，篩選平邑甜茶雜交率較高的時(shí)期，擴(kuò)大選擇范圍，增加平邑甜茶的雜交率和雜交種子數(shù)對(duì)育種工作具有重要意義。本研究利用“紅麗”海棠（二倍體）對(duì)平邑甜茶（三倍體）進(jìn)行授粉，分析不同授粉處理對(duì)平邑甜茶坐果率、果實(shí)生理性狀、倍性、后代實(shí)生苗率和雜種率的影響，并進(jìn)一步明確平邑甜茶有性生殖的機(jī)理與進(jìn)程，選擇出平邑甜茶雜交率較高的時(shí)期，以提高其雜交率，增加雜交種子數(shù)，擴(kuò)大選擇范圍，提高育種效率，從而為育種實(shí)踐提供重要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2015—2016年在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝科學(xué)與工程學(xué)院觀賞果園資源圃、作物生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.1 供試材料

母本和父本分別為山東農(nóng)業(yè)大學(xué)南校區(qū)觀賞果樹(shù)資源圃的平邑甜茶（2005年種植）、“紅麗”海棠（紅葉，2007年種植），選擇長(zhǎng)勢(shì)中庸、生長(zhǎng)較為整齊一致的健康苗木，統(tǒng)一田間管理。

1.2 試驗(yàn)處理

試驗(yàn)共設(shè)4個(gè)處理，分別為不去雄不授粉不套袋（T1）、去雄授粉套袋（T2）、套袋花開(kāi)后去雄授粉（T3）和去雄不授粉套袋（T4）。每個(gè)授粉組合選取3～5株長(zhǎng)勢(shì)相近、生長(zhǎng)健康的植株，每株選取生長(zhǎng)方位、粗度相似的枝干并隨機(jī)選取狀態(tài)基本一致的花序，每個(gè)花序保留1～2朵花，進(jìn)行不同的授粉處理（見(jiàn)表1），其余均按常規(guī)管理方式統(tǒng)一管理，定期對(duì)各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 平邑甜茶授粉后坐果率 在“紅麗”海棠花蕾期采集花粉，陰干備用。于2016年4月1日選擇一定數(shù)目的鈴鐺期平邑甜茶花蕾，一部分進(jìn)行去雄授粉套袋、去雄不授粉套袋處理，另一部分進(jìn)行套袋，待其花開(kāi)后（4月6日）去雄授粉。在授粉后4周（5月2日）、生理落果后（7月10日）和采果時(shí)（10月20日）統(tǒng)計(jì)各處理的坐果數(shù)，計(jì)算坐果率。

1.3.2 果實(shí)生理指標(biāo)的測(cè)量 果實(shí)單果重、種子千粒重和果實(shí)縱橫徑分別用電子秤和游標(biāo)卡尺進(jìn)行測(cè)量。

1.3.3 幼苗葉片顏色、出苗率和雜交苗率 試驗(yàn)所得雜交種，經(jīng)層積催芽處理（2016年1月10日—3月15日）后播種育苗并進(jìn)行精細(xì)管理。幼苗生長(zhǎng)約30天統(tǒng)計(jì)幼苗葉片顏色、出苗率和雜交苗率。

1.3.4 后代實(shí)生苗倍性測(cè)定 用已知倍性的父本“紅麗”海棠（2x）和母本平邑甜茶（3x）為對(duì)照，參照文獻(xiàn)[10]的方法取后代實(shí)生苗（經(jīng)層積催芽播種后15天）的嫩尖葉片（約0.5 cm2），放入帶蓋的塑料培養(yǎng)皿中加入200 μL裂解液后用雙面刀片（刀面垂直于葉片）快速剁碎，在室溫條件下放置3 min，然后加入800 μL染色緩沖液，在4℃條件下避光染色5 min，然后用Partec公司的 20 μm Cell Trics TM 濾網(wǎng)過(guò)濾樣品至樣品管中，上樣，利用流式細(xì)胞儀（德國(guó)）測(cè)定雜交實(shí)生苗的DNA含量，獲取DNA含量柱形圖，進(jìn)而根據(jù)DNA含量確定其倍性。

1.3.5 柱頭活性熒光檢測(cè) 參照文獻(xiàn)[11]和[12]的方法，人工授粉成功后，每隔12 h取一次柱頭樣品，72 h后停止取樣，在熒光顯微鏡下觀察拍照，并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 Microsoft Excel 2010和 DPS v7.05軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析與做圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同授粉處理對(duì)坐果的影響

由圖1可以看出，隨著時(shí)間的推移，各處理平邑甜茶坐果率呈逐漸降低的趨勢(shì)，5—7月的變化速率大于7—10月。不同處理的降速不同，T1處理降幅最顯著，5—7月和7—10月的坐果率分別降低10.17和3.36個(gè)百分點(diǎn)，到10月果實(shí)采收時(shí)坐果率為82.44%，明顯低于其他處理；T2、T3、T4 處理降幅較小，至10月時(shí)分別降低5.78、5.17和3.89個(gè)百分點(diǎn)，三者間差異不顯著。

2.2 不同授粉處理對(duì)平邑甜茶果實(shí)性狀的影響

由表2可以看出，平邑甜茶單果重和果實(shí)縱橫徑處理間存在顯著差異，T2處理的單果重和果實(shí)縱橫徑顯著高于其他處理，分別是T1處理的1.16、1.06、1.04倍；而T3、T4處理均顯著或不顯著低于T1，且兩者間差異不顯著。不同授粉處理的果形指數(shù)無(wú)顯著差異，果實(shí)均為圓柱狀。不同授粉處理對(duì)平邑甜茶種子形成影響不同，經(jīng)過(guò)人工授粉處理的平邑甜茶單果種子數(shù)顯著高于自然狀態(tài)下，且以T2處理最高，為T(mén)1處理的1.68倍。種子千粒重T2、T3、T4處理間差異不顯著，但均顯著高于T1，相比T1分別增加了8.33%、9.52%和8.33%，表明經(jīng)授粉處理的種子發(fā)育更為飽滿(mǎn)。

2.3 不同授粉處理對(duì)后代實(shí)生苗出苗率和雜種苗率的影響

在后代實(shí)生苗中，T1處理雜種苗率最高，為7.99%，授粉處理雜種苗率均低于T1，且T4處理無(wú)雜種苗（表3）。從后代實(shí)生苗中篩選出了含有父本性狀的實(shí)生苗，充分證明平邑甜茶是兼性無(wú)融合生殖。endprint

2.4 柱頭熒光活性檢測(cè)

由圖2可見(jiàn)，在人工授粉12 h后，柱頭上的花粉較多（圖2-1），隨著時(shí)間的推移，花粉逐漸減少（圖2-2、圖2-3），48 h后只有極少數(shù)花粉萌發(fā)（圖2-4），60 h后只有極少數(shù)的花粉管長(zhǎng)到花柱中間位置（圖2-5），72 h后花粉管停止生長(zhǎng)并出現(xiàn)萎蔫（圖2-6）。在所觀察的材料中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)花粉粒大量萌發(fā)的現(xiàn)象，只有極少量花粉管生長(zhǎng)到了花柱下端（圖2-7）。

2.5 平邑甜茶雜種后代實(shí)生苗倍性測(cè)定

經(jīng)測(cè)定，二倍體“紅麗”海棠和三倍體平邑甜茶的DNA相對(duì)含量分別為50和 84，理論推算二倍體DNA含量區(qū)間45～55，三倍體75～95，四倍體96～105（圖3）。對(duì)T1、T2、T3和T4處理分別選取74、83、32和100株紅葉雜交苗進(jìn)行倍性測(cè)定（表4），除T4處理100棵幼苗全部為三倍體，T1、T2、T3處理都出現(xiàn)了倍性分離，其后代實(shí)生苗變異率分別為52.70%、38.55%、46.88%。其中，T1處理后代實(shí)生苗倍性分離最明顯，出現(xiàn)了五倍體植株；T2處理四倍體出現(xiàn)概率最高，為19.28%，T3處理四倍體概率也較高，為15.63%，由此可見(jiàn)去雄授粉套袋處理有助于四倍體的出現(xiàn)。

表5為推斷出的后代實(shí)生苗染色體倍性組成。由表4和表5可以看出，平邑甜茶后代的大部分三倍體實(shí)生苗是經(jīng)無(wú)融合生殖產(chǎn)生的，少部分的三倍體和其余的整倍體、非整倍體需經(jīng)過(guò)有性胚囊成功受精后才能得到。說(shuō)明，平邑甜茶不僅有性生殖過(guò)程較為復(fù)雜，而且生成的有性雜種基因型也比較復(fù)雜。

3 討論

薛志霞等[8]對(duì)紅富士蘋(píng)果進(jìn)行異花授粉試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)“秦冠”花粉萌發(fā)量大，花粉管數(shù)量多且生長(zhǎng)快，坐果率高，而且種子數(shù)量多且各心室都有分布，與紅富士的親和性較好。寧偉等[9]對(duì)丹東蒲公英的專(zhuān)性無(wú)融合生殖特性研究表明，進(jìn)行去雄授粉套袋后其結(jié)籽率高達(dá)96%。本試驗(yàn)中人工授粉后平邑甜茶的種子千粒重顯著優(yōu)于自然授粉，這說(shuō)明授粉處理有助于受精卵的形成和發(fā)育，使種子更為飽滿(mǎn)。不同授粉處理中單果重以去雄授粉套袋處理最高，表明這一授粉處理有助于增產(chǎn)，這也解釋了人工授粉是產(chǎn)量穩(wěn)定的有效手段[10]。程光等[11]針對(duì)核桃落花落果嚴(yán)重，采取人工輔助授粉的方法，于4月下旬采集花粉選擇合適時(shí)間授粉，可顯著提高坐果率，而且在雌花開(kāi)不整齊時(shí)二次授粉可比一次授粉提高7個(gè)百分點(diǎn)的坐果率。陳琳等[12]研究也表明不同授粉方式對(duì)黃連木果實(shí)形狀和坐果率有顯著差異，其中抖授方式平均坐果率最高，果實(shí)含油量和種子千粒重最高，種子空殼率最低。本研究結(jié)果也表明，人工授粉平邑甜茶坐果率顯著高于自然授粉，高出8～9個(gè)百分點(diǎn)，特別是5—7月，人工授粉處理的坐果率下降速率明顯低于自然狀態(tài)。這可能由于柱頭上存在黏性物質(zhì)，人工授粉提高了附著柱頭的花粉量和花粉粘性，從而提高花粉萌發(fā)量，進(jìn)而促進(jìn)受精卵的形成，提高種子的飽滿(mǎn)程度和坐果率。李天忠[13]對(duì)自花和異花授粉“紅星”蘋(píng)果花粉管數(shù)進(jìn)行顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)自花授粉處理的花粉管數(shù)顯著少于異花授粉，異花授粉處理24 h后在花柱上部1/3處發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞排列緊密、單層管壁且形狀不規(guī)則的花粉管，48 h后可明顯看到伸長(zhǎng)的花粉管。本試驗(yàn)在對(duì)平邑甜茶人工授粉48 h后也明顯看到萌發(fā)的花粉管，這與前人研究結(jié)果一致。此外，圖像可見(jiàn)柱頭上的花粉數(shù)目逐漸減少，一方面可能是由于花粉的自然脫落，另一方面可能是由于柱頭上存在某種化學(xué)物質(zhì)將花粉降解，最終觀察到只有極少數(shù)花粉管長(zhǎng)到花柱下端，這說(shuō)明平邑甜茶可以進(jìn)行有性生殖，但有性生殖率較低。

孟素琴等[14]發(fā)現(xiàn)平邑甜茶和二倍體蘋(píng)果雜交后代實(shí)生苗中除三倍體外還含有少量四倍體和非整數(shù)倍體，且后代實(shí)生苗可以遺傳母本平邑甜茶的無(wú)融合生殖能力。沙廣利等[15]利用平邑甜茶與矮生有性砧木M9和B9等進(jìn)行雜交，測(cè)得無(wú)融合生殖率在88.1%～92.1%之間，后代分離出分枝型、小葉的個(gè)體；雜交得到的有性雜種雖然具有較高的無(wú)融合生殖坐果能力，但是后代仍然有性狀的分離。馬榮群等[16]用流式細(xì)胞儀和SSR技術(shù)對(duì)蘋(píng)果砧木青砧二號(hào)（三倍體）×寧8（二倍體）組合F1代雜種實(shí)生苗的22個(gè)單株進(jìn)行倍性分析，后代出現(xiàn)了3株四倍體植株。本研究通過(guò)對(duì)平邑甜茶ד紅麗”海棠雜交后代實(shí)生苗DNA含量的測(cè)定得到實(shí)生苗的倍性，發(fā)現(xiàn)去雄授粉套袋處理所測(cè)結(jié)果與前人一致，但自然狀態(tài)下得到了4株五倍體，可能是由于平邑甜茶所處環(huán)境海棠種類(lèi)眾多，多種海棠對(duì)其授粉造成的。不同授粉處理中去雄授粉套袋處理后代出現(xiàn)4倍體雜種苗概率明顯高于其他處理，表明可通過(guò)在花蕾期對(duì)平邑甜茶去雄授粉套袋獲得四倍體。本研究通過(guò)倍性測(cè)定推斷出平邑甜茶雌配子體的類(lèi)型為1x、2x和3x，這與沙廣利[15]的研究結(jié)果一致，但對(duì)于其三倍體后代實(shí)生苗具體是經(jīng)過(guò)有性生殖還是無(wú)融合生殖產(chǎn)生，尚需進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。

4 結(jié)論

平邑甜茶授粉后柱頭上的花粉萌發(fā)率低，只有極少數(shù)花粉可以生長(zhǎng)到花柱下端，人工授粉有助于提高坐果率和單果重，提高種子的飽滿(mǎn)程度和形成率。自然狀態(tài)下平邑甜茶無(wú)融合生殖率約為47.30%，后代實(shí)生苗大部分為三倍體，有少部分二倍體、四倍體、五倍體和非整數(shù)倍體。不同授粉處理的后代實(shí)生苗雜種率以自然狀態(tài)下最高，但花開(kāi)前去雄授粉套袋處理四倍體雜交苗率顯著高于其他處理。平邑甜茶可以進(jìn)行有性雜交，但生殖機(jī)能復(fù)雜。

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