剩余污泥處理中沙門氏菌的耐藥性及其抗性傳播機制綜述

孫書民，邢美燕，馬小杰，楊 健

（1.同濟大學環(huán)境與科學工程學院長江水環(huán)境教育部重點實驗室；2.上海市城市建設設計研究總院，上海 200092）

隨著經(jīng)濟的快速發(fā)展和城市化進程的不斷推進，我國每年需要處理大量的生活污水和工業(yè)廢水。2013年，我國處理城鎮(zhèn)污水產(chǎn)生的污泥達到2 300～3 700萬t（按污泥的含水率80%計算），并且有逐年增加的趨勢[1]。隨著污泥產(chǎn)量的大量增加，其帶來的環(huán)境安全風險逐年增大，尤其是剩余污泥中含有的病原菌，如在抗生素藥物濫用下產(chǎn)生的耐藥菌，在污泥利用最積極的出路——污泥農(nóng)用中對土壤及農(nóng)作物會產(chǎn)生嚴重的安全問題，甚至會對人類健康帶來威脅。

在剩余污泥處理處置的各類病原菌中，沙門氏菌尤其值得關注，作為一種典型的致病菌，感染沙門氏菌輕者會引起人頭疼、嘔吐、全身乏力等，重者會出現(xiàn)抽搐和昏迷的癥狀，甚至會致死[2]。沙門氏菌屬腸桿菌科、革蘭式陰性腸道桿菌，是一群形態(tài)、培養(yǎng)、生化反應和抗原構造相類似的重要腸道菌。沙門氏菌廣泛分布于自然界，是引起食物中毒的重要病原菌[3]。

關于沙門氏菌的耐藥性，一方面，抗菌藥物在人類和動物疾病防治屮的大量使用，使得沙門氏菌對抗菌藥物的耐藥性快速增長，特別是多重耐藥性，據(jù)報道全世界抗生素的使用量每年增加100 000～200 000 t[4]；另一方面，人們在河流、地下水、土壤等多種自然環(huán)境中檢查到了耐藥性沙門氏菌及耐藥基因，其中，生活污水及其處理終端城市污水處理廠是環(huán)境中耐藥沙門氏菌及耐藥基因的主要匯集地，污水廠處理的污水和排出的活性污泥成為耐藥性沙門氏菌的主要來源[5]。

近年來研究表明，沙門氏菌耐藥性的出現(xiàn)不僅與菌株長期接觸的環(huán)境含有多種抗菌藥物有關，還與其自身毒力基因的縱向和水平傳播存在一定關系，因此人們需要了解抗性的傳播。但是，目前關于沙門氏菌的耐藥性研究主要集中在食品和養(yǎng)殖場領域，關于剩余污泥的研究較少，實際上，處理終端城市污水的污水廠作為環(huán)境中多種抗生素及耐藥細菌和基因的匯集地，其中耐藥性的分布、排放和遷移傳播等各方面更應該受到人們的關注。鑒于此，本文主要圍繞沙門氏菌的耐藥情況，綜述了沙門氏菌的主要耐藥及抗性傳播機制，以期對更好地處理剩余污泥中的耐藥性沙門氏菌提供參考，減輕污泥后續(xù)農(nóng)用的風險。

1 沙門氏菌耐藥機制的綜合性描述

1.1 滅活酶和鈍化酶引起沙門氏菌耐藥

由于城市污水處理廠匯集了多種含不同抗生素的廢水（主要是生活廢水和醫(yī)院廢水等），并含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)及優(yōu)越的細菌生存條件，所以細菌長期處于富含抗生素的污水污泥里，很容易被誘導而產(chǎn)生滅活酶或鈍化酶，這兩種酶可以作用于抗生素使其失活，從而使抗生素無法正常發(fā)揮作用，進而產(chǎn)生耐藥性[6]。

目前研究發(fā)現(xiàn)，隨著抗生素的大量使用，細菌產(chǎn)生的滅活酶或鈍化酶主要是β-內(nèi)酰胺酶。沙門氏菌產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶是對β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥的主要機制，而β-內(nèi)酰胺酶主要包括AmpC頭孢菌素酶和超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）：AmpC頭孢菌素酶是由沙門氏菌的染色體和質(zhì)粒共同介導的，但產(chǎn)生耐藥性的酶主要由質(zhì)粒介導，其作用于頭孢菌素類抗生素使其失去活性而產(chǎn)生耐藥性；ESBLs由質(zhì)粒介導產(chǎn)生，其作用于頭孢菌素類、青霉素類等抗生素使其失活進而產(chǎn)生耐藥性，攜帶ESBLs基因的耐藥質(zhì)?？梢栽诓煌N或不同種屬間傳播，因此新型超廣譜β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥性的機制尤其值得人們注意。

同時，研究發(fā)現(xiàn)沙門氏菌可表達TEM、SHV、PER和CTX-M酶等多種ESBLs，因此這給掌握剩余污泥中沙門氏菌的耐藥性增加了難度[7]。通過研究污水廠產(chǎn)生的活性污泥，人們發(fā)現(xiàn)，blaTEM是活性污泥中β-內(nèi)酰胺抗生素抗性的唯一機制，而blaTEM基因編碼可以破壞β-內(nèi)酰胺抗生素結構的β-內(nèi)酰胺酶，這為減輕活性污泥中沙門氏菌的耐藥性提供了一種新的方法[8-9]。

沙門氏菌對氨基糖苷類抗生素產(chǎn)生耐藥的主要機制是可以產(chǎn)生鈍化酶，沙門氏菌通過分泌這些酶，修飾并改變氨基糖苷類藥物的結構，使得鈍化后的藥物不能進入膜內(nèi)與靶核糖體結合，從而產(chǎn)生耐藥性。研究發(fā)現(xiàn)，氨基糖苷類藥物修飾鈍化酶主要分為三類：乙酰轉(zhuǎn)移酶（AAC）、腺苷酸轉(zhuǎn)移酶（AAD）和磷酸轉(zhuǎn)移酶（APH）[10]。其中，AAC作用于氨基糖苷類及酰氨醇類抗生素，可以將氨基酸乙酰化；AAD和APH可作用于氨基糖苷類抗生素，其分別可以將羥基（-OH）腺化和磷酸化。隨著技術的不斷進步，編碼氨基糖苷類藥物修飾酶的基因會不斷在污水和剩余污泥中被發(fā)現(xiàn)，掌握這些基因編碼的工作原理，對于減輕剩余污泥中沙門氏菌耐藥性的傳播有至關重要的作用。

1.2 細菌外排泵作用引起沙門氏菌耐藥

藥物外排泵引起細菌耐藥主要分為兩種：染色體介導的多重藥物外排泵和染色體或質(zhì)粒介導的特異性藥物外排泵。研究發(fā)現(xiàn)，許多細菌可以通過外排泵系統(tǒng)將進入胞內(nèi)的抗菌藥物泵出胞外，從而使菌體內(nèi)藥物濃度降低而導致耐藥。目前發(fā)現(xiàn)鼠傷寒沙門氏菌的主要外排泵為AcrAB系統(tǒng)[11]。除此之外，沙門氏菌外排泵系統(tǒng)還有arcAB、arcEF、arcD、mdtABC、mdtK、mdsABC、mdfK、emrAB、macAB等9種形式[12]。

在沙門氏菌的外排泵中，最重要的是RND家族的AcrAB-ToLC外排泵，因為其可介導包括有機溶劑、染料（EB）、抗菌藥物（如四環(huán)素、頭孢菌素、氟喹諾酮類）等在內(nèi)的多重耐藥[13]。研究顯示，AcrABToLC外排泵系統(tǒng)中的染色體的acrAB主要受基因marRAB調(diào)控，編碼藥物外排泵AcrAB，而MarA與其他包括SoxS和Rob在內(nèi)的激活子一起調(diào)控marRAB基因的表達，在污水廠中檢出了較高濃度的多重耐藥基因MarA[14]。另外，外膜蛋白TolC是AcrAB的外排通道，是保持對抗生素耐受所必需的。MarA為正調(diào)控蛋白，其可以增強acrAB和TolC表達，使更多的胞內(nèi)物排出菌體，細菌的耐藥性增強。據(jù)報道，沙門氏菌對四環(huán)素、氨芐青霉素、氯霉素、三甲氧芐氨嘧啶等的多重耐藥性均與主動外排系統(tǒng)AcrAB有關[15]。

1.3 細菌生物膜改變引起沙門氏菌耐藥

細菌生物膜改變也可以引起沙門氏菌的耐藥性，其主要通過以下3個方面影響：OprD或CarO特異通道蛋白表達減低或缺失；OmpF或OprF等膜孔蛋白表達減低或缺失；外膜脂多糖脂改變。由于污水和污水處理廠產(chǎn)生的剩余污泥中含有各種抗生素藥物，細菌在長期接觸藥物的情況下，可以引起菌體細胞膜孔蛋白丟失，從而導致細胞膜通透性下降，引起低度耐藥。

另外，細菌在抗生素藥物的長期作用下，可通過自身產(chǎn)生的胞外多糖形成將自身包繞的細菌生物被膜，細菌生物被膜可以通過減少抗菌藥物滲透使抗菌藥物水解，從而使菌體產(chǎn)生耐藥性。同時，生物被膜的形成過程會影響編碼抗生素耐藥、代謝調(diào)節(jié)和膜轉(zhuǎn)運等功能的相關基因，從而導致菌株產(chǎn)生高度耐藥性[16]。據(jù)研究報道，沙門氏菌的耐藥性與細胞外膜蛋白（OMP）密切相關，有些血型的沙門氏菌會發(fā)生基因突變而降低細胞外膜蛋白的含量，從而使沙門氏菌對超廣譜β-內(nèi)酰胺類抗菌素的敏感性降低，進而引起細菌的耐藥性[17]。

同樣，研究發(fā)現(xiàn)具有生物被膜的沙門氏菌對多種抗生素可以產(chǎn)生耐藥性[18]。盡管細胞膜通透性下降不是沙門氏菌的主要耐藥機制，但是它與主動外排系統(tǒng)所產(chǎn)生的協(xié)同作用會導致沙門氏菌對四環(huán)素類等抗菌藥產(chǎn)生高度的耐藥性，所以沙門氏菌的生物膜改變引起的耐藥性在剩余污泥的處理中會越來越受到關注。

1.4 基因突變引起沙門氏菌耐藥

沙門氏菌會通過基因突變使其表達產(chǎn)物的空間構型和理化性質(zhì)變化，最終使藥物不能識別而產(chǎn)生耐藥性?？股刈饔冒形桓淖円鸬哪退幮缘念愋椭饕校嘿|(zhì)?；蛉旧w介導的16SrRNA甲基化酶改變；質(zhì)?；蛉旧w介導的23SrRNA堿基突變或甲基化酶改變；染色體介導的DNA促旋酶和拓撲異構酶改變。

喹諾酮類抗菌素主要是通過對DNA拓撲異構酶Ⅱ（又稱旋轉(zhuǎn)酶，包括GyrA和GyrB）和拓撲異構酶Ⅳ（ParC和ParE）的結合和抑制而導致耐藥。DNA拓撲異構酶Ⅱ由GyrA和GyrB2個亞基組成，GyrA的點突變一般在革蘭氏陰性菌株耐喹諾酮類藥物的機制中占主導地位。GyrA的突變會因微生物的不同而有所差異，在沙門氏菌中，GyrA的喹諾酮耐藥決定區(qū)（QRDR）位于GyrA蛋白第67（Ala）和106（Gln）氨基酸殘基之間（第199～318個堿基），最常發(fā)生突變在Ser-83，該位置通常突變?yōu)镻he、Tyr或Ala，在Asp-87位置常突變?yōu)镚ly、Asn或Tyr，使沙門氏菌產(chǎn)生對于喹諾酮類和氟喹諾酮類抗菌素的耐藥性[19]。

在研究活性污泥中的抗生素耐藥性時，人們發(fā)現(xiàn)了qnrD喹諾酮抗生素耐藥的唯一機制，qnrD編碼可導致在氟喹諾酮類靶向的DNA促旋酶和DNA拓撲異構酶IV發(fā)生突變[20]。另外，通過研究印第安納沙門氏菌對喹諾酮或氟喹諾酮藥物耐藥性，人們發(fā)現(xiàn)，印第安納分離株中都出現(xiàn)了GyrA和ParC突變，在83和87位點出現(xiàn)GyrA突變，主要包括S83F、D87G和D87N，而在57、72和80位出現(xiàn)ParC突變，主要包括S80R、T57S和C72G[21-22]。隨著分子生物學檢測手段的普及，關于基因突變引起的耐藥性會越來越引起人們的重視。

2 沙門氏菌耐藥性的傳播機制

質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子和整合子等可移動基因元件可攜帶一種或多種耐藥基因，通過水平轉(zhuǎn)移的方式在沙門氏菌種內(nèi)或菌種間傳播。基因的水平轉(zhuǎn)移是剩余污泥中耐藥性沙門氏菌傳播、轉(zhuǎn)移的重要途徑之一，其可導致沙門氏菌耐藥譜拓寬，耐藥性增強。所以，掌握沙門氏菌耐藥性的傳播機制，對于控制和降低剩余污泥中的耐藥性沙門氏菌至關重要。目前在污水污泥方面關于沙門氏菌耐藥性的傳播機制研究較多，主要從攜帶耐藥基因的載體包括轉(zhuǎn)座子、質(zhì)粒、整合子等方面進行研究。

2.1 轉(zhuǎn)座子介導的耐藥性傳播

轉(zhuǎn)座子存在于多種生物的基因組中，是連續(xù)性的、可移動的基因片。轉(zhuǎn)座子能夠攜帶耐藥基因在細菌染色體、質(zhì)?；蚴删w之間自由移動，因而可造成不同菌種甚至不同菌屬間傳播耐藥基因，導致耐藥性的傳播[23]。在眾多轉(zhuǎn)座子中，Tn3系列的復制轉(zhuǎn)座子是負責在革蘭式陰性菌中傳播抗生素抗性基因的主要系列[24]。轉(zhuǎn)座子發(fā)生轉(zhuǎn)座作用時有一個普遍特征，那就是受體分子中有一段很短的（3-12bp）的DNA重復序列，人們稱之為靶序列，它可以使插入的轉(zhuǎn)座子位于兩個重復的靶序列之間。

另外，有研究報道了攜帶armA、ant3、sul1和dfxII基因的轉(zhuǎn)子Tn1548和攜帶blaCTX-M-3基因的IncL/M質(zhì)粒共同介導多種抗生素耐藥性并在多種腸桿菌間的傳遞[25]。轉(zhuǎn)座子介導的耐藥性傳播是細菌產(chǎn)生多重耐藥性的機制之一，清楚了解轉(zhuǎn)座子的作用機制對于控制沙門氏菌的多重耐藥性是很重要的。

2.2 質(zhì)粒介導的耐藥性傳播

質(zhì)粒（Plasmid）是細菌擬核DNA外的遺傳物質(zhì)，是可以獨立于染色體外、能夠自我復制的DNA，其編碼的基因功能可賦予細菌毒性和耐藥性等特殊的生物學性狀。質(zhì)粒在同種屬或不同種屬革蘭氏陰性菌基因的轉(zhuǎn)移中起著主要作用，其通過結合、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導等方式使攜帶的耐藥質(zhì)粒在細菌間傳播。由質(zhì)粒攜帶耐藥基因進行擴散是沙門氏菌產(chǎn)生耐藥的重要機制，也是耐藥基因傳播的主要途徑。

很多耐藥基因存在于細菌的質(zhì)粒中，迄今為止在污水廠中發(fā)現(xiàn)多種攜帶耐藥基因質(zhì)粒的載體，包 括 pB2/pB3、pB4、pB10、pTB11、pRSB101、pRSB105、pRSB107、pRSB111、pGNB1、pGNB2等，這些質(zhì)?？蓴y帶對多種抗生素有抗性的耐藥基因[26-31]。沙門氏菌耐藥質(zhì)粒除以接合和轉(zhuǎn)化進行轉(zhuǎn)移外，還可通過轉(zhuǎn)導進行散播，已知具普遍轉(zhuǎn)導能力的溫和型噬菌體ES18和PDT17（λ噬菌體的P22類群）在沙門氏菌里普遍存在[32]。據(jù)報道，大多數(shù)從污水處理廠的活性污泥中分離出來的質(zhì)粒都屬于IncP-1α和IncP-1β不兼容組，這類質(zhì)粒具有廣泛的宿主范圍，并且具有高遺傳率及各種對抗生素藥物的抗性[33-34]。

通過PCR擴增的方法研究從污水廠污水中分離出的陽性腸桿菌編碼β-內(nèi)酰胺酶時，人們發(fā)現(xiàn)，編碼β-內(nèi)酰胺酶的基因主要是bla基因，而菌株中大部分編碼β-內(nèi)酰胺酶的基因都是由質(zhì)粒介導的[35]。另外，人們也從土耳其的鼠傷寒沙門氏菌分離株中的血清中鑒定出編碼β-內(nèi)酰胺酶的基因主要是bla基因，這也證實了質(zhì)粒介導的耐藥性[36]。從動物和人類多重耐藥、頭孢菌素類耐受沙門氏菌分離株檢測到攜帶CMY-2型β-內(nèi)酰胺酶的質(zhì)粒[37]。相似的研究均表明，質(zhì)粒介導的抗生素耐藥性通過接合作用可以在細菌抗性的產(chǎn)生和播散中以較高的頻率傳遞，并起著主導作用[38]。由此可見，這些質(zhì)粒獨立地通過可移動遺傳成分進行水平轉(zhuǎn)移獲得了相似的耐藥基因。

2.3 整合子介導的耐藥性傳播

整合子（Integron）是細菌菌體屮的一個具有捕獲外源基因并將其轉(zhuǎn)變?yōu)楣δ苄曰虻谋磉_単位，其主要存在于細菌染色體、質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)座子上，可引起耐藥性的廣泛傳播。由于其結構、功能與轉(zhuǎn)座子、整合型噬菌體及結合型質(zhì)粒相似，可在染色體質(zhì)粒及轉(zhuǎn)座子之間移動，故其可以歸為可移動基因元件。由于整合子基因盒中的基因大多為耐藥基因，因此整合子與細菌耐藥性的表達及傳播密切相關，以造成細菌的多重耐藥[39]。整合子基因盒可通過整合子的整合酶催化而特異性地結合于整合子上，并通過整合子上的啟動子作用得以表達，故又稱基因盒-整合子系統(tǒng)[40]。多重耐藥整合子中可含多達7種基因盒，其可以使耐藥菌株的數(shù)量和耐抗生素的種類增多[41]。

為了進一步研究沙門氏菌多重耐藥性與整合子基因盒之間的關系，人們對整合子PCR產(chǎn)物進行了DNA測序。測序結果顯示：Ⅰ類整合子攜帶了dfrA1、sat2和aadA1基因盒，其分別編碼對磺胺類、鏈絲霉素和氨基糖苷類抗生素藥物的耐藥性[42]。國外的一些研究也發(fā)現(xiàn)，編碼對鏈絲霉素和甲氧芐氨嘧啶的耐藥性基因盒最為常見，其中以dfrA1-aadA1基因盒組合最常見[43]。

另外，從挪威醫(yī)院廢水分離的90株腸炎沙門氏菌有20株（22.2%）含有整合子，并且其都攜帶耐藥基因[44]。研究結果說明，含有甲氧芐氨嘧啶和鏈霉素抗性基因的整合子通常與多重耐藥性腸炎沙門氏菌相關?？傊?，整合子的發(fā)現(xiàn)為進一步闡明沙門氏菌的耐藥性特別是多重耐藥性提供了新的思路，這對剩余污泥中耐藥性沙門氏菌的監(jiān)測具有實際意義。

2.4 毒力因子引起沙門氏菌耐藥

沙門氏菌的感染可以使人類致病，所以近年來，抗菌藥物的使用給人類治療相關疾病帶來了顯著的效果。但是，隨著抗生素等藥物的大量及不合理的使用，細菌的耐藥性變得越來越嚴重，這又給人類治療細菌類的疾病帶來新的挑戰(zhàn)。因此，人們在掌握了毒力因子會使沙門氏菌具有致病性的同時，也開始探討毒力因子與沙門氏菌耐藥性的關系。

沙門氏菌的毒力因子主要包括脂多糖、腸毒素、菌毛、毒力島、毒力質(zhì)粒及毒力基因等。隨著人們對細菌耐藥機制的深入研究，人們不僅發(fā)現(xiàn)了細菌耐藥性的出現(xiàn)與菌株長期處于環(huán)境中多種抗生素的選擇性壓力及耐藥基因通過質(zhì)粒或染色體在同種或不同種菌群間的廣泛傳播或擴散有關，還發(fā)現(xiàn)細菌耐藥性與毒力之間可能存在一定關系[45]。研究發(fā)現(xiàn)，所分離的腸炎沙門氏菌菌株的耐藥性尤其是多重耐藥性很高，值得注意的是所有分離株都攜帶invA、sefA、sipA和sopE2毒力基因[46]。此外，在菌株中還觀察到17種毒力譜，最常見的毒力譜是VP1（n=17；38.6%），其含有所有毒力基因。據(jù)研究報道，污水處理中的SBR工藝可有效去除各種毒力基因，通過SBR工藝的處理，各種毒力基因的濃度從進水的2.2×102～1.2×105copies/100 mL降低到出水的1.4×101～ 3.3×102copies/100 mL[47-49]。隨著毒力基因的去除，沙門氏菌的耐藥性也會受到抑制。在剩余污泥方面，關于毒力基因?qū)ι抽T氏菌耐藥性傳播的研究較少，這也是接下來探索污泥中沙門氏菌耐藥性傳播的主要方向之一。

3 結語

當今細菌的耐藥性已經(jīng)成為人們關注的熱點，特別是類似于沙門氏菌的致病菌在剩余污泥中大量存在，這給污泥的農(nóng)用帶來了難題。所以，在人們大量使用抗生素的影響下，沙門氏菌產(chǎn)生適應性的變異，耐藥機制也會變得更加復雜，隨著沙門氏菌的耐藥機制變得越來越復雜，人們要對沙門氏菌的耐藥機制、耐藥基因的傳播途徑等有更加全面復合的研究，這樣才能掌握沙門氏菌耐藥性的變遷，才能更好地解決污泥中沙門氏菌的耐藥性問題，減輕污泥農(nóng)用的風險，使污泥變廢為寶。