霍會永 ,劉冰 ,曹凌 ,趙現(xiàn) ,曹妍 ,薛靖 ,王如科 ,李軍濤 △
阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是老年人群中常見的一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變,臨床上以記憶力減退,語言功能障礙和認知能力降低為主要表現(xiàn),部分患者甚至出現(xiàn)行為和人格改變,嚴重影響了患者生活質(zhì)量[1]。隨著我國逐漸步入老齡化社會,AD患者的發(fā)病人數(shù)也呈逐年增加之勢。有關(guān)AD的發(fā)病機制尚不十分清楚,其主要病理改變?yōu)榇竽X皮質(zhì)和海馬區(qū)老年斑形成[2]。β-淀粉樣蛋白(βamyloid protein,Aβ)是具有強自聚性的難溶蛋白,是構(gòu)成老年斑的主要成分,降低腦內(nèi)Aβ的蓄積能夠有效延緩病程進展[3]。γ-分泌酶是調(diào)節(jié)Aβ生成的限速酶,對體內(nèi)Aβ的平衡具有重要的調(diào)節(jié)作用[4]。近年來有研究發(fā)現(xiàn),細胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導因子(extracellular matrix metalloproteinase inducer,CD147)可通過調(diào)節(jié)γ-分泌酶的生物活性,調(diào)節(jié)Aβ的生成,從而參與AD的發(fā)生、發(fā)展[5-6]。本文通過對AD模型大鼠腦室注射CD147 cDNA,以觀察其對模型大鼠學習記憶能力的干預,以及對大鼠腦組織Aβ和γ-分泌酶表達的影響,從而為AD的臨床治療提供思路。
1.1 實驗動物與試劑 Sprague-Dawley二級健康雄性大鼠60只,月齡5~6個月,均購自中國科學院北京斯萊克實驗動物中心(SCXK京2011-0012)。大鼠適應性飼養(yǎng)2周后用于實驗。CD147 cDNA委托上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設計合成。TRIzol總RNA提取試劑購自美國Invitrogen公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時熒光定量PCR試劑盒均購自美國ABI Applied Biosystems公司。兔抗大鼠一抗(抗Aβ、抗γ-分泌酶),辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG二抗,DAB顯色試劑盒均購自美國Santa Cruz公司。
1.2 實驗方法
1.2.1 動物分組、模型制備及給藥 采用隨機數(shù)字表法將60只大鼠分為假手術(shù)組、模型組及CD147組,每組20只。參照文獻[7]制備AD大鼠模型,取模型組和CD147組大鼠,10%水合氯醛(0.3 g/kg)腹腔注射麻醉,俯臥固定于鼠腦立體定位儀上。參照鼠腦立體定位儀圖譜,于前囟門后3.5 mm和中線右側(cè)2 mm處垂直進針,通過微量注射器于雙側(cè)海馬CA1區(qū)注入10μg的Aβ1~40,假手術(shù)組大鼠雙側(cè)海馬CA1區(qū)注入10μg生理鹽水,其余操作同模型組和CD147組。CD147組大鼠術(shù)后48 h,通過微量注射器于雙側(cè)腦室注射CD147 cDNA,模型組和假手術(shù)組大鼠于同一部位注射等量生理鹽水。術(shù)畢,牙科泥封住顱骨孔,抗生素預防感染。
1.2.2 大鼠學習記憶能力測試 采用Morris水迷宮實驗進行學習記憶能力測試。水迷宮為一圓形水池,直徑1.8 m,高0.55 m。距池壁0.35 m處放一圓形平臺,直徑0.1 m,高0.29 m。所有大鼠訓練5 d,每天上午訓練2次,下午訓練2次,相鄰兩次訓練間隔1 min。訓練時將大鼠面向池壁放入水中,觀察其爬上圓形平臺所需時間(即逃避潛伏期)。如果2 min內(nèi)仍未找到圓形平臺,則將其引導至圓形平臺,潛伏期記為2 min。訓練5 d后,撤除圓形平臺,在訓練時的同一入水點,大鼠面向池壁入水,觀察其在2 min內(nèi)跨過原圓形平臺所在位置的次數(shù)。
1.2.3 Western blot檢測蛋白表達 Morris水迷宮實驗結(jié)束后,3組大鼠各取15只,腹腔麻醉后處死,取出包含海馬組織的腦組織,置入玻璃勻漿器碾碎,冰浴下加裂解液。裂解30 min,轉(zhuǎn)移至離心管,4℃下10 000 r/min離心5 min,取上清蛋白液。BCA法測定蛋白濃度,-20℃保存?zhèn)溆谩?00μg蛋白上樣,經(jīng)8%的SDS-PAGE電泳分離,轉(zhuǎn)至PVDF膜。TBST漂洗,5%脫脂奶粉室溫封閉1 h,兔抗大鼠一抗(抗Aβ、抗γ-分泌酶)工作液,4℃孵育過夜。TBST漂洗,加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗工作液,37℃孵育1 h。TBST漂洗,暗室內(nèi)ECL顯色、曝光。Image J軟件分析條帶光密度(OD)值,目的蛋白相對表達量=目的蛋白光密度值/內(nèi)參βactin光密度值。
1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件進行分析,符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析,組內(nèi)比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
2.1 各組大鼠逃避潛伏期時間比較 各組大鼠逃避潛伏期時間隨著訓練時間的增加均縮短。從第3天開始,模型組大鼠逃避潛伏期時間較假手術(shù)組延長,而CD147組較模型組減少,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表1。
Tab.1 The comparison of escape latencies between three groups表1 各組大鼠逃避潛伏期時間比較(n=20,s,±s)
Tab.1 The comparison of escape latencies between three groups表1 各組大鼠逃避潛伏期時間比較(n=20,s,±s)
**P<0.01;a與假手術(shù)組比較,b與模型組比較,P<0.05;表2、3 同
2.2 各組大鼠空間探尋能力比較 模型組大鼠經(jīng)過平臺次數(shù)和經(jīng)平臺停留時間較假手術(shù)組減少,而CD147組較模型組均增加,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表2。
2.3 各組腦組織Aβ和γ-分泌酶表達比較 模型組大鼠腦組織Aβ和γ-分泌酶表達較假手術(shù)組增加(P<0.05),而CD147組較模型組減少,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表3、圖 1。
Tab.2 The comparison of spatial searching abilities between three groups表2 各組大鼠空間探尋能力比較(±s)
Tab.2 The comparison of spatial searching abilities between three groups表2 各組大鼠空間探尋能力比較(±s)
Tab.3 ComparisonofexpressionsofAβandγ-secretasein brain tissues of rats between three groups表3 各組大鼠腦組織Aβ和γ-分泌酶表達比較 (±s)
Tab.3 ComparisonofexpressionsofAβandγ-secretasein brain tissues of rats between three groups表3 各組大鼠腦組織Aβ和γ-分泌酶表達比較 (±s)
Fig.1 Comparison of expressions of Aβ and γ-secretase in brain tissues of rats between three groups圖1 各組大鼠腦組織Aβ和γ-分泌酶表達比較
學習記憶能力下降是AD患者早期認知功能損害的主要臨床特征。本研究通過海馬區(qū)注射Aβ1~40,制備 AD 模型大鼠,Morris水迷宮實驗結(jié)果顯示,AD模型大鼠逃避潛伏期時間較假手術(shù)組顯著延長,經(jīng)過平臺次數(shù)和經(jīng)平臺停留時間較假手術(shù)組明顯減少,表明AD模型大鼠出現(xiàn)明顯的學習記憶能力減退。通過對AD模型大鼠雙側(cè)腦室注射CD147 cDNA,觀察其對AD模型大鼠學習記憶能力的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),CD147組大鼠逃避潛伏期時間較模型組大鼠顯著減少,經(jīng)過平臺次數(shù)和經(jīng)平臺停留時間較模型組大鼠顯著增加,表明外源性CD147 cDNA能夠顯著提高AD模型大鼠記憶學習能力,減輕Aβ1~40所致的學習記憶障礙。
有關(guān)AD的病因迄今尚不明確,一般認為AD是由于遺傳、免疫、環(huán)境等多種因素所致的復雜性病變。研究指出,Aβ在大腦皮質(zhì)和海馬區(qū)沉積是引起AD發(fā)病的關(guān)鍵因素[8]。Aβ由39~43個氨基酸殘基形成,其C-末端存在12個疏水氨基酸殘基,N-末端存在28個氨基酸殘基位于細胞膜外,所以具有很強的自聚性,易在腦組織形成難溶性的淀粉樣纖維沉積物[9]。Aruoma 等[10]研究顯示,腦組織 Aβ 沉積可引起淀粉樣血管炎,直接引起腦組織血供、氧供障礙。譚展望等[11]認為Aβ可促進Bax表達而抑制Bcl-2表達,從而誘導神經(jīng)元細胞凋亡。Arora等[12]研究顯示,Aβ可損害膽堿能神經(jīng),而后者與人類學習和記憶功能緊密相關(guān)。本研究結(jié)果顯示,模型組大鼠腦組織Aβ表達較假手術(shù)組顯著增加,這也證實了Aβ可能參與了AD的發(fā)生、發(fā)展;而CD147組大鼠腦組織Aβ表達較AD模型大鼠顯著降低,說明外源性CD147 cDNA可顯著減少腦組織Aβ表達,減輕Aβ沉積所引起的大鼠記憶學習障礙。
γ-分泌酶主要參與體內(nèi)多個重要跨膜蛋白的切割,可切割C99而生成Aβ,是調(diào)節(jié)Aβ生成的限速酶[13]。所以γ-分泌酶的生物活性對Aβ的生成和AD的發(fā)病均至關(guān)重要。CD147是一種跨膜糖蛋白,在多種組織和細胞中均有表達,與腫瘤的發(fā)生、視網(wǎng)膜功能和多種神經(jīng)退行性疾病等密切相關(guān)。有研究認為CD147參與了對γ-分泌酶生物活性的調(diào)控。Zhou等[14]干擾 HeLa細胞 CD147表達,發(fā)現(xiàn)細胞γ-分泌酶表達顯著增加,而Aβ的生成亦明顯增加。張錦巍等[15]過表達小鼠胚胎成纖維細胞CD147,發(fā)現(xiàn)細胞γ-分泌酶表達下降,同時Aβ的生成明顯減少。智孔亮等[16]通過CD147 cDNA轉(zhuǎn)染人神經(jīng)母細胞瘤細胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn)γ-分泌酶和Aβ的表達均明顯減少。本研究結(jié)果顯示,CD147組大鼠腦組織γ-分泌酶表達較AD模型大鼠顯著降低,這也證實了在AD模型大鼠腦組織中存在同樣的表達調(diào)控,即CD147對γ-分泌酶的活性起著負調(diào)節(jié)作用。
綜上所述,外源性CD147能夠顯著改善AD模型大鼠學習記憶能力,其具體機制可能與調(diào)節(jié)γ-分泌酶活性和下調(diào)Aβ的表達有關(guān)。
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