CryNGc蛋白在轉(zhuǎn)基因玉米和大腸桿菌中表達的等同性研究

趙方方, 劉 洋, 井樂剛, 尹悅佳 , 馮樹丹*, 劉相國*

1.哈爾濱師范大學生命科學與技術(shù)學院, 哈爾濱 150025; 2.吉林省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所, 吉林省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室, 長春 130033

由于BT蛋白具有廣譜殺蟲效果，因此能夠代替化學殺蟲劑在農(nóng)田中廣泛應用[1]。但是在BT生物殺蟲劑的使用過程中，科學家們發(fā)現(xiàn)部分昆蟲對原有的BT蛋白產(chǎn)生了抗性[2]。因此發(fā)現(xiàn)新的抗蟲基因?qū)τ跀U大抗蟲譜和增加殺蟲效果具有重要作用。

利用新的抗蟲基因得到的轉(zhuǎn)基因抗蟲作物需要進行安全性評價。根據(jù)《轉(zhuǎn)基因植物安全評價指南》對于轉(zhuǎn)基因植物新表達蛋白食用安全性評價的規(guī)定，若用體外表達的蛋白質(zhì)作為安全性評價的實驗材料，需提供體外表達蛋白質(zhì)與植物中新表達蛋白質(zhì)等同性分析的資料[3]。在安全評價過程中，需要提供大量外源蛋白，而轉(zhuǎn)基因作物本身產(chǎn)生的外源蛋白一般含量很低，而且難以富集和純化，無法滿足實驗需要[4]，經(jīng)常需要通過原核生物或真核生物等體外表達系統(tǒng)來誘導表達外源基因所編碼的蛋白。本實驗所用的基因cryNGC是吉林省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所開發(fā)的具有自主知識產(chǎn)權(quán)的抗蟲基因(專利號：CN104725516 A)[5]。本研究利用大腸桿菌表達系統(tǒng)成功表達了CryNGc抗蟲蛋白，并且利用His標簽純化了該蛋白；通過SDS-PAGE、Western Blot、質(zhì)譜分析對抗蟲蛋白CryNGc與理論表達蛋白進行了等同性分析。CryNGc蛋白的等同性研究可以為今后該轉(zhuǎn)基因作物的環(huán)境釋放提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1植物材料 轉(zhuǎn)cryNGc基因抗蟲玉米種子由吉林省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所提供。

1.1.2菌株與質(zhì)粒 原核表達載體pCzn1、表達菌株Arctic-Express和大腸桿菌感受態(tài)TOP10菌株購自南京鐘鼎生物技術(shù)有限公司。

1.1.3主要試劑與耗材 聚丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、過硫酸銨、四甲基乙二胺(TEMED)購自上海生工生物工程有限公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG) 購自 Sigma 公司，Proteinlso Ni-NTA Resin Kit、瓊脂糖、Blue Plus Ⅱ Protein Marker、2×EasyTaqSuperMix、Easysee Western Blot Kit、兔源二抗購自北京全式金生物公司； Cry1Ab一抗購自Abcam 生物公司；配制培養(yǎng)基所用的胰蛋白胨、酵母提取物購自 Oxoid 生物公司； 限制性內(nèi)切酶購自 Thermo Fisher 科技公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。0.45 μm無菌濾器和PVDF印跡膜購自Millipore 生物公司；其他耗材購自上海生工生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1原核表達載體的構(gòu)建 采用基于 PAS(PCR-based accurate synthesis)的方法合成全長為 1 833bp 的基因cryNGc。依據(jù)目的基因和載體 pCzn1 的多克隆位點設計一對引物cryNGc-F：5’-CCATATGGGTTGCCCATTGTCCCATA-3’；cryNGc-R：5’-CTCTAGAGCCGAACATAAACGAGTGC-3’，上游引物和下游引物分別引入酶切位點NdeⅠ和XbaⅠ(下劃線所示)，經(jīng) PCR 擴增、膠回收后，將回收的基因與載體 pCzn1 連接(圖1)，獲得重組質(zhì)粒pCzn1-cryNGc；將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入 TOP10 菌株中然后涂布于含有氨芐青霉素(Amp)的 LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃ 過夜培養(yǎng)；挑取單克隆后，以所選單克隆為模板進行 PCR 檢測獲得陽性克??；將其擴大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定無誤后送生物公司測序。

圖1 原核表達載體pCzn1-cryNGc的構(gòu)建Fig.1 Construction of expression vector pCzn1-cryNGc注：cspA：大腸桿菌冷休克基因啟動子；TEE：煙草蝕紋病毒增強子；cryNGc：抗蟲目的基因；Amp：氨芐青霉素抗性基因；LacⅠ：大腸桿菌乳糖操縱子調(diào)節(jié)基因

1.2.2重組質(zhì)粒 pCzn1-cryNGc的表達 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化參考陳洪棟等[6]的方法；蛋白表達參考林亨咪[7]的方法，然后將每步的樣品進行 SDS-PAGE 分析。

1.2.3包涵體蛋白的變復性 包涵體的變性以及復性相關實驗步驟參考付明娟等[8]的方法。

1.2.4表達后重組蛋白的純化 用 Ni-NTA Agroase 進行重組蛋白的純化，以 5～10 倍體積的平衡緩沖液平衡柱子，待液體流盡之后，加入上述溶解之后的包涵體溶液，以 5～10 倍體積的含有 20 mmol/L咪唑的緩沖液洗脫雜蛋白2次，液體流盡后，以含有 250 mmol/L 咪唑的洗脫液洗脫目的蛋白。

1.2.5轉(zhuǎn)基因玉米葉片蛋白的提取 溫室種植轉(zhuǎn)cryNGc基因植株，長至 5～6 葉期時采集葉片進行 PCR 檢測，在已檢測的植株中，選取轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因植株各3株作為蛋白提取材料備用。轉(zhuǎn)基因植株和非轉(zhuǎn)基因植株每株各取 1 g，液氮研磨之后裝入 15 mL 離心管中，每管中加入 6 mL 蛋白提取緩沖液(每 10 mL PBS加 1 片蛋白酶抑制劑)，渦旋振蕩混勻后，4℃ 12 000 g 離心 10 min，取上清即為植物總蛋白，-20℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6Western Blot 分析 取預染Marker、純化后的 CryNGc 蛋白、誘導后的菌體蛋白、超聲波破碎后的菌體蛋白、轉(zhuǎn)基因玉米蛋白、空載體(pCzn1)進行 SDS-PAGE(5%濃縮膠和12%分離膠)，80V 電壓下跑出濃縮膠后，再將電壓調(diào)至 120 V，待溴酚藍跑出膠外停止電泳；然后進行轉(zhuǎn)膜(半干轉(zhuǎn)，10 V 轉(zhuǎn)膜，觀察預染 Marker 完全轉(zhuǎn)印到膜上之后停止轉(zhuǎn)膜，大約40 min)，將轉(zhuǎn)好的膜放入封閉液(5%的脫脂奶粉)25℃ 封閉 1.5 h 之后，進行一抗(1∶1 000)、二抗(1∶5 000)孵育，洗膜之后在暗室進行發(fā)光、壓片、顯影，最后對膠片進行掃描，得到結(jié)果。

1.2.7LC-MS-MS(液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜)分析

從考馬斯亮藍染色的膠上切下直徑 0.3 mm 的目標蛋白膠條，以膠內(nèi)消化脫色液(50%乙腈，25 mmol/L碳酸氫銨)對膠粒消化脫色2次，待膠粒脫水至完全變白時真空抽干乙腈；加入 10 mmol/L 二硫蘇糖醇(DTT)，56℃ 水浴鍋內(nèi)孵育 1 h，孵育完畢后移除多余的 DTT；加入 55 mmol/L 的碘代乙酰胺(IAM)，暗室孵育 45 min，孵育完畢后移除多余的 IAM，加入 25 mmol/L 的碳酸氫銨清洗2次，每次10 min；移除碳酸氫銨，以脫色液清洗 2 次，每次 10 min，真空抽干乙腈；將1 μg/μL的胰蛋白酶用 25 mmol/L 的碳酸氫銨稀釋 15 倍后加入到膠粒中，37℃ 水浴過夜消化；取 10 μL 樣品上機用質(zhì)譜儀檢測，結(jié)果進行 Mascot 檢索(http://www.matrixscience.com)比對。

2 結(jié)果與分析

2.1 原核表達載體的構(gòu)建與驗證

將陽性克隆擴大培養(yǎng)后提質(zhì)粒進行酶切鑒定，結(jié)果表明(圖2)，已成功從原核表達載體上切得1 833 bp的目的基因，未酶切的質(zhì)粒有3條帶是因為質(zhì)粒本身有著不同的形態(tài)所導致。將質(zhì)粒送公司測序，結(jié)果表明原核表達載體 pCzn1-cryNG構(gòu)建成功。

圖2 表達載體 pCzn1-CryNGc的酶切驗證結(jié)果Fig.2 Restriction enzyme digestion of expression vector pCzn1-CryNGc.注：M：DL 15 000 Marker；1：酶切前的質(zhì)粒；2：酶切后的質(zhì)粒

2.2 重組蛋白的表達和純化

蛋白表達結(jié)果如圖3A所示，CryNGc 重組蛋白以包涵體形式在沉淀中表達，上清中未見蛋白表達。箭頭所示為目的蛋白條帶，大小約為 65 kDa，根據(jù)理論推測蛋白大小為 60～67 kDa，實際大小在預測范圍之間，在電泳過程中，電泳液的酸堿性以及電壓的穩(wěn)定性都會影響電泳結(jié)果，因此會存在誤差，所以實驗結(jié)果是可信的。本實驗采用的啟動子為大腸桿菌冷休克啟動子，因此在圖3A泳道2所示37℃時蛋白表達量小于泳道4的13℃。蛋白純化結(jié)果如圖3B所示，未純化的包涵體蛋白和 20 mmol/L的咪唑洗滌后的蛋白都有拖尾，而以250 mmol/L咪唑洗脫之后的蛋白如箭頭所示無拖尾現(xiàn)象，表明得到了純化后的蛋白。

2.3 轉(zhuǎn)cryNGc基因玉米總蛋白的提取和檢測

轉(zhuǎn)基因玉米蛋白檢測結(jié)果如圖4所示，和野生型玉米相比，轉(zhuǎn)基因玉米有如箭頭所示的目的蛋白條帶，證明 CryNGc 蛋白在轉(zhuǎn)基因玉米中能成功表達。

圖3 CryNGc 重組蛋白的表達及純化Fig.3 Expression and purification of recombinant CryNGc protein.注：A. CryNGc重組蛋白的表達：M: 蛋白質(zhì)分子量標準; 1:未誘導的重組蛋白; 2:誘導后的重組蛋白; 3: 0.5 mmol/L IPTG誘導后的上清; 4: 0.5 mmol/L IPTG誘導后的沉淀。B. CryNGc重組蛋白的純化：M:蛋白分子量標準; 1:未純化的包涵體溶液; 2:20 mmol/L咪唑洗滌流出液; 3: 250 mmol/L咪唑洗脫純蛋白。

圖4 轉(zhuǎn)基因玉米CryNGc蛋白的 SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of protein CryNGc in transgentic maize.注：M: 蛋白分子量標準; 1：野生型玉米; 2：轉(zhuǎn)基因玉米

2.4 Western Blot分析

Western Blot 結(jié)果如圖5，陽性對照、誘導后的蛋白、破碎后的包涵體蛋白、轉(zhuǎn)基因玉米蛋白都得到如圖條帶，空載體和轉(zhuǎn)基因陰性植株無條帶，cryNGc基因在大腸桿菌和轉(zhuǎn)基因玉米中都能進行表達且大小一致，與陽性對照相比，泳道2條帶較粗，原因是CryNGc蛋白以包涵體形式表達，在未經(jīng)超聲波破碎的條件下目的蛋白處于折疊狀態(tài)，純度不高，所以雜交結(jié)果不如純化后的蛋白?？梢钥闯龅鞍椎募兌雀叩蛯τ赪estern Blot實驗結(jié)果至關重要。

圖5 CryNGc 原核蛋白和轉(zhuǎn)基因玉米蛋白的 Western Blot 結(jié)果Fig.5 The Western Blot results of CryNGc protein in E. coli and transgenic maize.注：1：陽性對照(CryNGc純蛋白)；2：誘導后的蛋白沉淀；3：超聲波破碎后的蛋白沉淀；4：轉(zhuǎn)基因玉米；5：空載體；6：非轉(zhuǎn)基因玉米

2.5 pCzn1-cryNGc原核蛋白和轉(zhuǎn)基因玉米蛋白的質(zhì)譜分析

以 CryNGc 重組蛋白和轉(zhuǎn)基因玉米蛋白做質(zhì)譜分析，然后將質(zhì)譜結(jié)果用 Mascot 檢索比對，因為cryNGc基因是從cry1Ab基因改造而來，因此以 CryNGc 重組蛋白和轉(zhuǎn)基因玉米蛋白和 Cry1Ab 蛋白比對，結(jié)果如圖6所示，劃線部分為兩種蛋白和 Cry1Ab 蛋白的成功匹配部分并且氨基酸序列相同。因為在數(shù)據(jù)庫中Cry1Ab蛋白是已知的，以它為橋梁將原核表達蛋白和轉(zhuǎn)基因玉米蛋白聯(lián)系起來進行對比，結(jié)果證明兩種蛋白在氨基酸序列上存在等同性。

3 討論

利用原核表達的外源蛋白代替植物蛋白進行等同性實驗和其他一系列驗證實驗對于提高實驗效率有著重要的作用。但是以微生物表達的蛋白代替轉(zhuǎn)基因植物中目的蛋白, 需要符合以下等同性驗證標準：①兩者在二維凝膠電泳中表現(xiàn)一致；②具有相同的結(jié)合單克隆、多克隆抗體的免疫反應性；③具有相同的翻譯后修飾(如糖基化)；④具有相似的氨基酸序列( N 末端 10～15 個氨基酸序列至少 3 個短的內(nèi)部蛋白序列)[9]。本實驗選取了免疫活性和相似的氨基酸序列兩項指標。大腸桿菌表達的蛋白和植物蛋白在 SDS-PAGE 凝膠上大致位置相同，分子量相近；在 Western Blot 分析中，兩種蛋白條帶和陽性對照基本處于同一位置，證明兩種蛋白具有相同免疫反應，這和徐海濱等[10]在研究cry1Ie基因時所得的 Western Blot結(jié)果相同，也符合cry系列抗蟲基因在免疫活性的一致性；參考李敏[11]對兩種蛋白做的質(zhì)譜檢測，結(jié)果利用 Mascot 檢索比對，原核表達蛋白、植物蛋白和抗蟲蛋白 Cry1Ab 的氨基酸匹配區(qū)段相同，證明兩種蛋白的氨基酸組成基本一致。就目的蛋白的關鍵特性——氨基酸序列和免疫活性而言，實驗結(jié)果表明大腸桿菌表達系統(tǒng)產(chǎn)生的目的蛋白與轉(zhuǎn)基因植物目的蛋白基本是等同的，可以在后續(xù)的安全評價實驗中發(fā)揮作用。盡管利用原核表達系統(tǒng)表達目的蛋白得到的蛋白量比較少，但是也為等同性的驗證提供了可行的方法，如果利用發(fā)酵工藝在工業(yè)水平上表達和純化蛋白，將會解決實驗室所得蛋白量少的問題，為后續(xù)在環(huán)境安全評價中的蛋白等同性實驗提供了可行的方法。

圖6 Mascot 比對結(jié)果Fig.6 Mascot comparison results.A.原核表達蛋白和Cry1Ab蛋白氨基酸序列比對；B.轉(zhuǎn)基因玉米蛋白和Cry1Ab蛋白氨基酸序列對

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