體外受精中無(wú)原核胚胎新鮮周期移植與子代出生結(jié)局的臨床分析

許展 程?hào)|凱 劉雙 趙雨杰

體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization andembryo transfer,IVF-ET)過(guò)程中，正常受精是指卵子于授精后16～20 h呈現(xiàn)2個(gè)清晰的原核(pronuclei,PN)，同時(shí)有2個(gè)極體(polar body,Pb)[1]。IVF-ET周期中優(yōu)先選擇來(lái)源于2PN的胚胎進(jìn)行移植，但有很多周期中含有未見原核(0PN)的胚胎。有文獻(xiàn)報(bào)道，在IVF-ET周期中，約有30%～40%的卵子在鏡下觀察表現(xiàn)為未見原核，這部分胚胎能否用于移植、如何選擇尚存在爭(zhēng)議[2]。也有報(bào)道顯示，如果在沒(méi)有正?？衫门咛サ那闆r下移植0PN(可見2極體)來(lái)源胚胎可生育健康子代[3]。本文通過(guò)在本生殖中心接受完全來(lái)源0PN(可見2極體)的卵裂期胚胎新鮮移植周期的病例進(jìn)行回顧性分析，患者的妊娠情況，以期了解0PN(可見2極體)卵裂期胚胎的臨床應(yīng)用價(jià)值。

對(duì)象與方法

1.對(duì)象：選擇2012年5月—2016年3月在本中心接受IVF-ET治療(包括常規(guī)IVF和常規(guī)ICSI)的患者中，新鮮移植周期移植完全來(lái)源0PN但可見2極體胚胎的145例婦女。

2.方法

(1)促排卵方案：促排卵采用常規(guī)長(zhǎng)方案、短方案或拮抗劑方案。B超監(jiān)測(cè)卵泡發(fā)育情況，當(dāng)出現(xiàn)1～2個(gè)主導(dǎo)卵泡直徑≥18 mm時(shí)注射絨毛膜促性腺激素(HCG)(珠海麗珠醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司)5 000～10 000 IU后約36～38 h在B超引導(dǎo)下經(jīng)陰道取卵。

(2)精液的準(zhǔn)備：患者丈夫取卵日上午手淫取精。采用密度梯度離心后上游法處理精液標(biāo)本，將吸出的液體置于CO2培養(yǎng)箱中備用。

(3)體外受精-胚胎培養(yǎng)：IVF授精為取卵后2～4 h。精子的授精濃度為(5～10)×105ml。精卵共同培養(yǎng)4～5 h后，脫顆粒細(xì)胞，將卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)皿培養(yǎng)。ICSI是取卵后2h受精后16～20 h觀察原核的形成，第2天(D2)第3天(D3)觀察胚胎發(fā)育情況。

(4)授精評(píng)估：授精后16～19 h觀察原核。2PN是正常受精，判斷標(biāo)準(zhǔn)：可見2個(gè)原核且可見極體。0PN判斷為可見2個(gè)極體未見原核。0PN 2極體判斷為2個(gè)極體之間有可辨的距離。1PN判斷為可見極體和僅見1個(gè)原核。根據(jù)授精情況不同分組培養(yǎng)。145例婦女均是受精卵D1未見2PN胚胎，D3觀察到0PN卵裂來(lái)源的胚胎，在患者知情同意后，移植0PN來(lái)源的胚胎。

(5)胚胎評(píng)分及移植：我中心D3卵裂期胚胎評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為Ⅰ級(jí)：卵裂球等大均勻，無(wú)核碎片≤10%，胞漿飽滿，質(zhì)地均勻；Ⅱ級(jí)：卵裂球大小輕度不一致、不對(duì)稱，無(wú)核碎片10%～20%，胞漿飽滿，質(zhì)地均勻度稍差；Ⅲ級(jí)：卵裂球大小不一致，不對(duì)稱，無(wú)核碎片20%～50%，胞漿濃縮，質(zhì)地粗糙；Ⅳ級(jí)：卵裂球大小形如碎片不一致，不對(duì)稱，無(wú)核碎片≥50%，胞漿顆粒不均勻；其中Ⅰ～Ⅲ級(jí)為可利用胚胎予以移植，移植分裂期胚胎1～2枚。優(yōu)胚：本實(shí)驗(yàn)室將取卵后第三天，正常受精且發(fā)育速度正常的胚胎發(fā)育至6～8個(gè)細(xì)胞，卵裂球大小均一、碎片無(wú)或小于20%，這些胚胎定義為優(yōu)質(zhì)胚胎，其他胚胎(如發(fā)育速度過(guò)慢，碎片過(guò)多)均定義為非優(yōu)質(zhì)胚胎。

(6)觀察指標(biāo)及定義：D3胚胎移植后14 d測(cè)尿和血清hCG，若陽(yáng)性定義為生化妊娠；于移植29 d后行B超檢測(cè)，以宮腔內(nèi)可見孕囊及胎心定義為臨床妊娠。定期隨訪，記錄出生嬰兒健康情況。

結(jié)果

145例患者的年齡為22～49歲，平均(37.7±5.4)歲。完全來(lái)源0PN(可見2極體)的卵裂期胚胎新鮮移植周期中IVF 123個(gè)周期，ICSI 22個(gè)周期，共獲得卵子546枚，平均獲卵(3.8±4.3)枚，成熟卵子數(shù)411枚，D1天0PN卵子/胚胎280枚，D2天0PN卵裂胚胎245枚，卵裂率為87.5%(245/280)，優(yōu)胚139枚，優(yōu)胚率為56.7%，共移植198枚胚胎，周期平均移植數(shù)1.37個(gè)，D3胚胎著床率為17.7%(35/198)。

臨床妊娠28例，胎停2例、無(wú)胎心1例、異位妊娠1例、感染引產(chǎn)1例、流血流產(chǎn)1例，22例孕婦活產(chǎn)分娩：23例活產(chǎn)嬰兒(1例雙胎，為1男1女，其余單胎分別為13男，8女)體檢均未見異常，臨床妊娠率為19.3%(28/145)。

討論

在輔助生殖技術(shù)助孕過(guò)程中，一般選擇2PN來(lái)源的胚胎進(jìn)行移植，并認(rèn)為此類胚胎為形態(tài)發(fā)育正常的胚胎。但有部分卵子在D1觀察判斷受精時(shí)未見到原核，但D2天又發(fā)生卵裂，甚至一部分能發(fā)育成形態(tài)正常的胚胎[4]。一般認(rèn)為，此類胚胎不適合進(jìn)行移植。但有研究表明，0PN(可見2極體)中也存在正常受精的胚胎，這些胚胎染色體正常[5]。

0PN的形成機(jī)制可能有以下幾個(gè)方面：①未受精；②由于原核形成延遲，原核尚未出現(xiàn)或由于原核提前融合而過(guò)早消失以至在授精后16～20 h 顯微鏡下無(wú)法觀察到原核[6-7]。0PN胚胎可能出現(xiàn)如下情況：①正常受精；②正常受精但存在非整倍體異常[8]；③未受精：孤雌激活，指處于第二次減數(shù)分裂中期的成熟卵母細(xì)胞不經(jīng)過(guò)精子受精，而在某些理化因素的刺激下恢復(fù)并完成第二次減數(shù)分裂，發(fā)生卵裂形成早期胚胎；二倍體雙雌胚胎，表現(xiàn)為未見原核及單個(gè)極體(1PB)，其形成機(jī)制可能是未分裂出來(lái)的第二極體參與到核遺傳物質(zhì)的形成[9]；④各種異常受精：多精受精、精子染色體解聚異常、雌性原核形成異常等[10]。由此可見，0PN胚胎中有一部分是正常受精的胚胎[11]。有資料顯示，IVF授精后觀察為0PN的卵子中大約有20%可發(fā)育成正常的胚胎；還有文獻(xiàn)報(bào)道，0PN胚胎的發(fā)生率是12.7%～20.0%[12]。

本研究臨床妊娠28例，22例活產(chǎn)，活產(chǎn)出生者體檢均未見異常。流產(chǎn)病例沒(méi)有對(duì)絨毛進(jìn)行染色體檢測(cè)，無(wú)法判斷移植的胚胎本身是否正常。以上結(jié)果表明，0PN(可見2極體)來(lái)源的卵裂期胚胎進(jìn)行移植可獲得正常妊娠結(jié)局。因此，如果沒(méi)有正常受精(2PN)胚胎移植時(shí)，可考慮移植來(lái)源0PN(可見2極體)的胚胎，但如何選擇正常的胚胎進(jìn)行移植需要進(jìn)一步研究和探討；選擇來(lái)源0PN的正常胚胎，我們可以注意以下幾點(diǎn)：①對(duì)來(lái)源0PN的胚胎，注意選擇2個(gè)極體的胚胎；②盡可能將來(lái)源0PN的胚胎培養(yǎng)至囊胚，從而使胚胎得到進(jìn)一步的自然篩選[13]；③盡量在授精后16～20 h之間觀察原核；④可以選擇時(shí)差(Time-lapse)攝像系統(tǒng)連續(xù)觀察胚胎，以避免因局限某一時(shí)間觀察胚胎而致 PN 數(shù)的誤判[14]；⑤也可將來(lái)源 0PN的胚胎進(jìn)行 PGS檢測(cè)后再行移植[15]。

綜上所述，無(wú)2PN胚胎的情況下，在充分告之病人知情后可行移植0PN但可見2極體胚胎，并需對(duì)臨床妊娠過(guò)程及結(jié)局嚴(yán)密觀察追蹤。