循環(huán)腫瘤細胞檢測的臨床有效性和實用性分析

徐訓政 張好剛 喬鵬飛 綜述 王夫景 審校

循環(huán)腫瘤細胞(Circulating tumor cells，CTC)及其檢測技術最初于1869年被報道[1]，伴隨著重復性檢測技術的發(fā)展，CTC現(xiàn)已在幾類主要腫瘤疾病中作為診斷、預后判斷或預測的生物標記物。本文從循環(huán)腫瘤細胞的臨床有效性和實用性角度出發(fā)，對循環(huán)腫瘤細胞現(xiàn)有相關研究進行綜述。

1 CTC檢測技術

CTC最初發(fā)現(xiàn)于1869年，循環(huán)腫瘤細胞即存在于外周循環(huán)血內(nèi)的腫瘤細胞，CTC是腫瘤組織的一部分，以現(xiàn)有技術，濃度大于1個/mL的CTC可以被檢出。理想的CTC檢測平臺需要在數(shù)量眾多的正常細胞中檢測并分離出多樣的CTC。CTC的篩選是檢測的第一部分，通常要經(jīng)過陽性或陰性的篩選和富集，之后通過檢測步驟把CTC和正常細胞進行辨別和顯示。

CTC的篩選基于這些細胞的生物化學或生物物理學特征。細胞表面抗原表達的不同有利于區(qū)分陽性篩選的CTC和陰性篩選的白細胞，生物物理學的篩選方式以CTC與白細胞在細胞大小、變形能力、生物電性或者密度方面的差異作為篩選條件。完成CTC富集后，需要使用高分辨率成像技術和免疫細胞熒光染色技術相結合來鑒別被捕獲細胞。通常意義上的CTC檢測的是具有EpCAM+/cytokeratin+/DAPI+/CD45特征的血液內(nèi)細胞[2]。值得一提的是，基于mRNA表達檢測的驗證技術因其結果不具備特異性，本文暫不做歸納。不同的技術可以捕獲不同表型的CTC，針對不同類腫瘤細胞，其各自的敏感性及特異性也有所不同。

2 循環(huán)腫瘤細胞作為血液活檢方式的應用現(xiàn)狀

傳統(tǒng)的活組織檢查具有侵入性、花費高、費時、潛在風險及治療期間重復性低等弊端，而CTC檢測作為一種新的檢測方法，在避免上述弊端的同時，收集到的CTC理論上也能完成各種在傳統(tǒng)病理學標本上進行的檢測和實驗。例如，在乳腺癌CTC上進行的點突變[3]、ERBB2擴增[4]、拷貝數(shù)變異[5]、DNA甲基化[6]、轉(zhuǎn)錄組學、蛋白質(zhì)組學分析[7-8]結果均已被證實結果可靠。

CTC數(shù)量取決于所應用的技術和被檢血液樣本的容量并最終影響各種生物標記物統(tǒng)計結果的準確性。在早期或轉(zhuǎn)移性乳腺癌中，我們已經(jīng)證實在低CTC數(shù)量(小于5個/7.5 mL)的患者中，免疫細胞熒光檢測的HER2水平評估結果并不可靠[9]。許多其他的檢測方式需要較多的被檢樣本，因此也需要大量的CTC或者預先分析擴增來獲得更多人造樣本。除了上述基于CTC的生物標記物檢測技術的固有限制，循環(huán)腫瘤DNA的發(fā)展也限制了CTC檢測技術與DNA突變統(tǒng)計的相關性，尤其對單一核苷酸突變來說。但是，對于復雜染色體的重排(例如易位)的檢測，CTC檢測技術較循環(huán)腫瘤DNA技術更為簡單和可靠。

CTC檢測對比循環(huán)腫瘤DNA檢測技術的優(yōu)勢在于可以應用更多種類的檢測方法作為單一DNA序列統(tǒng)計的補充，特別是針對腫瘤細胞表達的mRNA和蛋白質(zhì)的檢測意義更加重大。蛋白質(zhì)是許多抗腫瘤藥物實際的作用目標，并作為調(diào)整治療的根據(jù)。在前列腺癌的研究中，對阿比特龍和恩雜魯胺耐藥性的產(chǎn)生現(xiàn)已被證實和雄激素受體的mRNA剪接變異有關(AR-V7)[10]，PD-L1[11]和雌激素受體[12]這兩種蛋白質(zhì)的表達受腫瘤調(diào)控，并影響免疫檢查點阻滯劑和激素療法效果。

目前為止，并無經(jīng)過驗證的CTC檢測技術作為液體活檢技術的臨床實踐，CTC檢測技術的準確性與經(jīng)濟性有待更深入的研究與評估。

3 循環(huán)腫瘤細胞的臨床有效性

3.1 癌癥篩查

通過Cell search技術進行的早期非轉(zhuǎn)移癌的研究通常呈現(xiàn)非常低的CTC檢測率(根據(jù)腫瘤類型不同，檢測率為5%～30%[13-15])。不僅如此，此種檢測技術的特異性也不盡如人意，一些循環(huán)上皮細胞在感染性疾病患者甚至正常人血液內(nèi)均可被檢出。因Cell search技術的敏感性和特異性不高，該技術作為腫瘤篩查工具的使用大為受限。盡管大多數(shù)CTC檢測技術也并沒有更好的表現(xiàn)，但以基于過濾的檢測技術ISET在早期肺癌檢測中表現(xiàn)驚人。在初期報告中，F(xiàn)iorelli等發(fā)現(xiàn)CTC計數(shù)大于25，可以幫助區(qū)分肺癌患者和有胸部影像學異常的良性病變患者[16]。Ilie等應用相同的技術發(fā)現(xiàn)，在煙草誘導的慢性阻塞性肺疾病患者中，僅檢測出CTC的患者，在隨訪過程中罹患肺癌風險更高[17]。

3.2 循環(huán)腫瘤細胞檢測對轉(zhuǎn)移癌的預后判斷價值

對于升高的CTC計數(shù)對預后的評估，最有力的臨床證據(jù)來源于20個研究的，共1 944名轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者的合并分析[18]。研究表明，在開始新的治療方法之前，46.9%的患者有大于5個/7.5 mL的CTC計數(shù)，這些患者與CTC計數(shù)小于5個/7.5 mL的患者相比，有更短的無進展生存期(PFS)及總生存期(OS)。Meta分析表明，在結腸癌患者中，升高的CTC計數(shù)基線(應用Cell search[19]技術或RT-PCR免疫染色技術)可以作為獨立的預后判斷因素來評估患者的PFS及OS[20]。CTC檢測技術的預后價值在化學治療期間也被證實[21-22]。在一項第二階段研究中，Krebs等發(fā)現(xiàn)，具有升高的CTC計數(shù)基線(大于等于3個/7.5 mL)的患者將會在密集的化學療法中較比較低CTC計數(shù)的患者獲益更多[23]。這些結果表明，CTC計數(shù)可作為調(diào)整結直腸癌患者化學治療方案的依據(jù)。

在轉(zhuǎn)移性前列腺癌研究中，尤其對于去勢抵抗性前列腺癌來說，CTC多次被證實為獨立預后因素[24]。在一項包括711名經(jīng)過多西他賽治療的去勢抵抗性前列腺癌患者的前瞻性研究中，Scher等證明經(jīng)多西他賽治療12周后CTC計數(shù)升高是有力的預后因素[25]。

3.3 循環(huán)腫瘤細胞檢測對非轉(zhuǎn)移癌的預后判斷價值

在乳腺癌輔助治療和新輔助治療研究中，CTC被普遍研究[13]。一項樣本量大于2 000人的新輔助治療的Meta分析證實CTC可作為獨立預后因素[26]。CTC計數(shù)的增加意味著更差的預后和無遠處轉(zhuǎn)移生存率、總體生存率、無局部復發(fā)生存率。炎性乳癌的CTC檢測率較高(約為40%)[27]，而在非炎性乳癌中檢測率較低(化療前約為20%，術前約為15%[13])。在乳腺癌術后研究中，Rack等發(fā)現(xiàn)CTC檢測也是預后因素之一[28]。在這些研究中，CTC是一個獨立于淋巴結轉(zhuǎn)移、乳腺癌大小、分期分級的預后因素。

在局部晚期胰腺癌的LAP07試驗中，盡管CTC的檢出率僅為7%，CTC檢測仍被證實為整體生存期的獨立預后因素。類似結論在非轉(zhuǎn)移性結腸癌的CTC檢測或術前RT-PCR試驗中也得到了證實。與之不同的，在一項包含472名患者的前瞻性研究中，術后CTC檢測與較差患者受益并不相關[29]，在這項研究中，Van Dalum等檢測了患者術前、術后的CTC，檢出率分別為24%和20%，但只有術前的循環(huán)細胞檢測可以作為預后因素。目前對這種出現(xiàn)在結直腸CTC檢測中臨床現(xiàn)象尚無合理解釋。在接受過輔助性化療的高危結腸癌患者中，檢出CTC的患者復發(fā)幾率更高[29]。在其他非轉(zhuǎn)移性腫瘤研究中，CTC檢測的預后價值相對要小。有小范圍研究表明，術后CTC檢測陽性的患者復發(fā)率較高[30]。

CTC檢測在某些局部、轉(zhuǎn)移性腫瘤患者中，可作為獨立的預后因素。然而，因受到現(xiàn)有檢查方法所限，在非轉(zhuǎn)移性腫瘤患者體內(nèi)，CTC檢測的應用有限。不僅如此，在乳腺癌的CTC檢測標準為5個mL/CTC，而在其他局部腫瘤患者體內(nèi)，該標準僅為1個mL/CTC，值得注意的是，不同檢測方法所定義的檢測標準也有所不同。在CTC計數(shù)方面，數(shù)量高、低這種二值化表達方法應用廣泛。無論如何，CTC計數(shù)的絕對值有預后價值，具有非常高CTC計數(shù)患者的預后通常很差[31]。檢測時機對于患者體內(nèi)的CTC的檢出也十分重要，術前、術中、術后不同時間檢出的CTC擁有不同的生物學、臨床意義。目前，CTC檢測在微小殘留病灶檢測方面的敏感性和特異性仍然無法與ctDNA相比[32]。

3.4 檢測與治療效果

諸多研究表明，在轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者群體中，具有較低CTC基數(shù)的患者預后要好于CTC基數(shù)持續(xù)升高的患者。與血漿腫瘤標記物(CEA或者CA153)不同，在治療期間綜合應用CTC計數(shù)或其變式可以明顯提高基于病理和臨床特征的預后判斷模型的準確性[18]。相似結果也在轉(zhuǎn)移性結腸癌研究中得到證實[21-22]。在轉(zhuǎn)移性乳腺癌的觀察研究中，擁有持續(xù)降低CTC計數(shù)和擁有持續(xù)較低腫瘤細胞計數(shù)的患者總體收益相似。CTC水平的變化在經(jīng)過多西他賽治療的去勢抵抗性前列腺癌[33-34]及小細胞肺癌患者中，已被證實為預后因素之一。

因在非轉(zhuǎn)移性腫瘤疾病治療過程中檢出率較低，循環(huán)腫瘤細胞計數(shù)的臨床有效性被明顯限制。依據(jù)稀有事件的泊松定律，患者治療前CTC計數(shù)為1，治療后CTC計數(shù)為0，并不能認為治療后患者CTC的真正減少。同樣，經(jīng)歷新輔助化療后，乳腺癌患者的CTC計數(shù)減少和病理學改變并不明顯相關[13]。在輔助治療期間，持續(xù)可檢出的CTC和不良預后相關，但增高的CTC計數(shù)患者預后不會更差[28]。在預測和評估卵巢癌患者化療效果方面，CTC計數(shù)的監(jiān)測要比血清腫瘤標記物CA125更為準確[35]。一個包含80名患者的第二階段試驗表明，非轉(zhuǎn)移性胃癌患者在新輔助化療期間持續(xù)減少的CTC計數(shù)是獨立的預后生存因素[36]。

3.5 循環(huán)腫瘤細胞作為體液活檢材料

CTC檢測數(shù)量是任何以CTC作為活檢材料的技術都要解決的重要問題。例如，檢測循環(huán)乳腺癌腫瘤細胞的HER2試驗中，在低CTC計數(shù)的患者中，這一結果并不可靠。據(jù)此，任何類型的預測性試驗結果的正確性都有賴于患者的高CTC計數(shù)，所以想要提高以CTC為活檢材料的試驗準確性，需要根據(jù)患者CTC計數(shù)的高和低制定不同的方案[37]。

4 循環(huán)腫瘤細胞檢測臨床實用性

CTC檢測的臨床有效性已得到肯定，在推廣到臨床實踐之前，其實用性仍然有待證實。CTC的實用性研究需要包括以下三方面：(1)使用CTC作為活檢材料；(2)在治療過程中，CTC計數(shù)和變化的意義；(3)在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中，CTC的生物學特征和特異性。研究人員需要找到一種特異表達于CTC而非所有實體腫瘤細胞都表達生物標記物或分子過程。因CTC反映了腫瘤的異質(zhì)性，針對CTC的預后試驗、藥物反應試驗有助于提高患者收益。

4.1 基于循環(huán)腫瘤細胞計數(shù)或其衍生試驗的治療

在一項針對基線CTC計數(shù)實用性在一線雌激素受體陽性轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者的三期隨機臨床調(diào)查研究中(NCT01710605)，一線治療方案(雌激素治療或化療)由臨床醫(yī)師決定或根據(jù)基線CTC計數(shù)決定：針對CTC低計數(shù)的患者使用雌激素治療，較高計數(shù)患者使用一線化療方案。該試驗的理論依據(jù)是與醫(yī)師決定治療方案所依據(jù)的臨床預后因素相比，CTC計數(shù)更為有效、準確。

在Smerage等對乳腺癌患者在治療過程中監(jiān)測CTC計數(shù)變化實用性的研究中，CTC計數(shù)大于5個/mL的經(jīng)歷第一輪化療的患者被隨機分組，較早的接受第二輪化療。實驗結果表明，較早的更換化療方案并不能提高患者的總體生存率[38]。

4.2 基于循環(huán)腫瘤細胞生物標記物表達的治療方案

目前基于CTC生物標記物表達的研究數(shù)量有限。在乳腺癌的研究中，拉帕替尼被分別應用于HER2陽性或EGFR陽性的CTC中，在這兩組研究中，并沒有發(fā)現(xiàn)預期的腫瘤反應，這一現(xiàn)象可能是由于拉帕替尼單一療法在HER2陽性乳腺癌的有限療效造成的。另外一項研究中，接受過新輔助治療的隨機打亂的75名HER2陰性或陽性的乳腺癌女性患者被分組接受曲妥單抗或單純觀察[39]，在36名HER2陰性患者中，共有27名(75%)患者接受了曲妥單抗治療后，變?yōu)镃K19 mRNA陰性；觀察組中，這一比率為17.9%，曲妥單抗降低了疾病復發(fā)率，并延長了患者的無病生存期。

5 小結與展望

雖然CTC技術已被證實為有力的預后因素并可以檢測治療效果，但其缺乏臨床實用性，故CTC技術仍無法應用到日常的臨床實踐中。大規(guī)模持續(xù)的臨床研究，尤其在乳腺癌領域，可以決定CTC檢測能否改變臨床實踐。然而，現(xiàn)有的循環(huán)細胞檢測技術利用細胞上皮生物標記物來捕捉CTC，但循環(huán)間質(zhì)腫瘤細胞或循環(huán)干細胞樣腫瘤細胞表達的上皮生物標記物十分有限，而間質(zhì)腫瘤細胞或干細胞樣腫瘤細胞在腫瘤的轉(zhuǎn)移和耐藥性方面又起到重要作用，這也降低了CTC檢測的臨床實用性。CTC檢測的臨床有效性的提高有助于新抗癌策略的出現(xiàn)，檢測敏感性的提高有助于改善對療效的持續(xù)監(jiān)測、腫瘤篩查和用CTC作為體液活檢材料的病理學研究[30]。相信隨著CTC技術的進步，將會為腫瘤的診斷、治療、預后提供更有力的支持。

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