肝癌組織中抗凝血酶Ⅲ基因表達(dá)的臨床意義

文娟娟 瞿 兵 劉 超

肝癌是我國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其死亡率占惡性腫瘤死亡率的第二位[1-2]。肝癌起病隱匿，大多數(shù)患者初次診斷時(shí)，便已進(jìn)入中晚期，預(yù)后較差。對(duì)于未轉(zhuǎn)移病例，手術(shù)切除和肝移植是肝癌根治的主要治療方法。肝癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制已研究多年，但發(fā)病機(jī)制仍不清楚。肝炎病毒感染、長(zhǎng)期飲酒等因素導(dǎo)致的多基因異常與肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3]。因此，從基因水平研究肝癌病理機(jī)制對(duì)明確肝癌發(fā)病、提高早期診斷率、尋找治療靶點(diǎn)、改善預(yù)后至關(guān)重要?？鼓涪?Antithrombin-Ⅲ，AT3)，又稱(chēng)作絲氨酸蛋白酶抑制劑C家族成員1(Serpin family C member 1，SERPINC1)，是血漿中一種蛋白酶抑制劑，具有抗凝血功能。研究報(bào)道，手術(shù)前AT3水平與肝癌根治性切除術(shù)后的生存率密切相關(guān)，且給予AT3可以降低肝癌切術(shù)術(shù)后肝衰竭發(fā)生率[4-5]，提示AT3可能參與了肝癌的病理機(jī)制。目前，尚無(wú)研究系統(tǒng)論述肝癌組織中AT3表達(dá)的臨床意義。為此，本研究利用公共數(shù)據(jù)庫(kù)中肝癌基因表達(dá)譜及相應(yīng)臨床數(shù)據(jù)，探討肝癌組織中AT3表達(dá)水平與其臨床特征及預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 收集數(shù)據(jù)資料

從GEO(Gene Expression Omnibus)公共數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gds)中下載肝癌基因表達(dá)譜及相關(guān)臨床數(shù)據(jù)(GSE14520)。GSE14520包含兩個(gè)芯片平臺(tái)，分別為Affymetrix HT Human Genome U133A Array(GPL3921)和Affymetrix Human Genome U133A 2.0 Array(GPL571)。應(yīng)用GPL3921和GPL571平臺(tái)檢測(cè)肝癌組織的病例數(shù)分別為220例和22例。所有標(biāo)本提取RNA后，經(jīng)過(guò)生物素標(biāo)記后與芯片雜交，采用GeneChip scanner 3000掃描，應(yīng)用GCOS1.0進(jìn)行初步分析。本研究為了排除平臺(tái)差異，僅選用GPL3921平臺(tái)檢測(cè)的220例肝癌數(shù)據(jù)。

1.2 數(shù)據(jù)篩選及分組

220例肝癌病例中，排除6例臨床數(shù)據(jù)缺失的病例，保留214例臨床數(shù)據(jù)完整的病例。臨床數(shù)據(jù)中，所有病例的腫瘤轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)是根據(jù)其標(biāo)本中分子指紋(Gene signature)的表達(dá)情況來(lái)確定，該分子指紋是由Roessler等發(fā)現(xiàn)的161個(gè)基因的表達(dá)譜所組成[6]。基因表達(dá)譜中，所有基因的相對(duì)表達(dá)量均以探針信號(hào)強(qiáng)度以2為底數(shù)對(duì)數(shù)化后的值衡量。AT3基因?qū)?yīng)的檢測(cè)探針為210049_at，為特異性探針。根據(jù)探針號(hào)，提取214例樣本對(duì)應(yīng)的AT3基因表達(dá)數(shù)據(jù)，然后根據(jù)該基因的表達(dá)水平進(jìn)行由高到低排序后，前50%的樣本(n=107)作為高表達(dá)組，后50%的樣本(n=107)作為低表達(dá)組。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件和GraphPad 5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料的單因素分析采用卡方檢驗(yàn)。生存資料的單因素分析采用Log-rank檢驗(yàn)，多因素分析采用Cox回歸分析，P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料

共214例肝癌病例納入研究，平均年齡50.7歲，男性占86.4%(185/214)，97例(45.3%)血清甲胎蛋白含量大于300 ng/mL，87例(40.7%)病例血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)含量大于50 U/L，77例(36.0%)腫瘤直徑大于5 cm，44例(20.6%)多發(fā)結(jié)節(jié)，197例(92.1%)合并肝硬化，TNM分期Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期分別有89、77、48例(41.6%、36.0%、22.4%)，103例(48.1%)具有轉(zhuǎn)移高風(fēng)險(xiǎn)。

2.2 肝癌組織AT3基因表達(dá)水平及其與臨床特征的關(guān)系

單因素分析發(fā)現(xiàn)，AT3低表達(dá)組中，血清AFP含量較高(P<0.001)，腫瘤體積較大(P=0.015)，TNM分期較差(P=0.001)，轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)較高(P<0.001)，而年齡、性別、血清ALT含量、結(jié)節(jié)數(shù)目、合并肝硬化等因素與AT3基因表達(dá)水平無(wú)顯著性關(guān)系(P>0.05)(表1)。

2.3 肝癌預(yù)后影響因素分析

214例患者中位隨訪時(shí)間為51.5個(gè)月，共84例患者死亡。單因素生存分析發(fā)現(xiàn)，腫瘤體積較大(P=0.023)、多發(fā)結(jié)節(jié)(P=0.047)、合并肝硬化(P=0.016)、TNM分期較差(P<0.001)、高轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)(P=0.001)及AT3低表達(dá)(P=0.005)與肝癌患者預(yù)后有關(guān)(圖1，表2)。多因素Cox回歸分析亦提示AT3表達(dá)水平是肝癌患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素(HR=0.850，95%CI：0.745～0.970，P=0.016)(表3)。

圖1 肝癌組織中抗凝血酶III基因不同表達(dá)水平的生存曲線Figure 1 Survival curves of HCC patients with low or high expression of AT3

表1 肝癌組織抗凝血酶III基因(AT3)表達(dá)水平及其與臨床特征關(guān)系

Note：AFP：alpha-fetoprotein；ALT：alanine aminotransferase.

表3 肝癌預(yù)后影響因素的多因素分析

表2 肝癌預(yù)后影響因素的單因素分析

3 討論

抗凝血酶Ⅲ基因又稱(chēng)作絲氨酸蛋白酶抑制劑C家族成員1(Serpin family C member 1，SERPINC1)，位于人第1號(hào)染色體q25.1區(qū)域，由八個(gè)外顯子構(gòu)成。該基因編碼的蛋白質(zhì)含416個(gè)氨基酸，是血漿中一種蛋白酶抑制劑，可以抑制凝血酶和凝血系統(tǒng)中其它激活的絲氨酸蛋白酶，調(diào)控凝血與抗凝血平衡?；虮倔w發(fā)現(xiàn)，該基因不僅能抑制內(nèi)肽酶活性，還可以結(jié)合蛋白酶、肝素、黏多糖以及含硫化合物，主要參與凝血相關(guān)生物過(guò)程，也參與炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)。

目前，關(guān)于AT3的研究主要集中在凝血系統(tǒng)疾病，在肝癌中研究不多。Asmal等發(fā)現(xiàn)AT3可以抑制感染細(xì)胞株的丙肝病毒，同時(shí)下調(diào)與肝硬化、肝癌相關(guān)的多個(gè)宿主細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，包括Jun、Myc和BMP2[7]。Mizuquchi等對(duì)158例首次肝癌切除術(shù)后的患者進(jìn)行回顧性分析后發(fā)現(xiàn)，與ICGR15相比，術(shù)前血清AT3水平對(duì)術(shù)后肝功能異常/肝衰竭更有預(yù)測(cè)價(jià)值[8]。Iwako等將440例肝癌根治性切除術(shù)患者根據(jù)術(shù)前血AT3活性分成高低兩組(閾值70%)，分析發(fā)現(xiàn)術(shù)前AT3高活性組手術(shù)后，總體生存率和無(wú)病生存率均顯著高于低活性組(P=0.005；P=0.011)，多因素分析亦提示相同結(jié)果[4]。Kuroda等對(duì)肝癌切除術(shù)后患者給予靜脈AT3治療后，與對(duì)照組相比，治療組肝衰竭發(fā)生率顯著低于對(duì)照組(16.3%vs. 44.2%，P<0.01)[5]。相關(guān)研究報(bào)道顯示血清AT3水平下降是結(jié)腸癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌等腫瘤復(fù)發(fā)和預(yù)后的危險(xiǎn)因子[9-10]。這些研究均提示AT3在肝癌中可以起到抑癌作用，與本研究結(jié)論一致。

關(guān)于AT3在腫瘤中的作用機(jī)制較為復(fù)雜。有研究報(bào)道AT3與腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移相關(guān)。Kurata等發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸癌大鼠模型中，AT3可以阻止肝缺血再灌注導(dǎo)致的結(jié)腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[11]。AT3在肝癌中的作用機(jī)制主要與調(diào)控其靶點(diǎn)蛋白的腫瘤生物學(xué)活性相關(guān)。首先，巨噬細(xì)胞抑制因子(Macrophage inhibitory factor，MIF)是AT3的作用靶點(diǎn)之一，參與了多種腫瘤細(xì)胞的增殖和浸潤(rùn)，而AT3可以通過(guò)與MIF形成復(fù)合物來(lái)降低MIF的生物活性[12]。其次，AT3的另一底物凝血酶可促進(jìn)多個(gè)腫瘤相關(guān)病理過(guò)程，如腫瘤細(xì)胞-血小板黏附、腫瘤細(xì)胞組織浸潤(rùn)和腫瘤血管生成等[13]。Kaufmann等[14]研究發(fā)現(xiàn)多種肝癌細(xì)胞系表達(dá)凝血酶受體，加入凝血酶后可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞遷移。第三，骨橋蛋白在肝癌細(xì)胞中高表達(dá)，并與肝癌的預(yù)后、早期復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[15]。凝血酶可將骨橋蛋白分解成兩個(gè)相同大小的片段，這些片段可以通過(guò)激活整合素β-黏著斑激酶信號(hào)通路，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖和黏附[16]。因此，AT3可以通過(guò)抑制凝血酶來(lái)調(diào)控肝癌的發(fā)生發(fā)展。

本研究通過(guò)公共數(shù)據(jù)庫(kù)中基因芯片的肝癌表達(dá)譜數(shù)據(jù)及相應(yīng)臨床數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，確認(rèn)了AT3表達(dá)在肝癌中的臨床意義。研究發(fā)現(xiàn)，AT3在肝癌中可能起到抑癌基因作用，與相關(guān)基礎(chǔ)研究結(jié)果一致，為該基因的進(jìn)一步研究提供了理論基礎(chǔ)，同時(shí)，也為該基因應(yīng)用于精準(zhǔn)醫(yī)療診斷和治療提供了理論支持。其次，本研究共納入了214例標(biāo)本，樣本量較大，臨床信息較全，彌補(bǔ)了相關(guān)領(lǐng)域研究樣本量小、臨床信息缺失的不足。

綜上所述，肝癌組織中，AT3表達(dá)水平與患者臨床特征及預(yù)后相關(guān)，其低表達(dá)可能是影響肝癌預(yù)后的危險(xiǎn)因素之一。

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