Lsa蛋白對金黃色葡萄球菌介導的炎性細胞因子表達的影響

衛(wèi)瑞陽 白杰 徐彬 席燕燕 王琳燚 王改利付趁 魏鳳仙 李紹鈺

（1. 河南省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，鄭州 450002；2. 河南農(nóng)業(yè)大學牧醫(yī)工程學院，鄭州 450002；3. 河南省飼料與養(yǎng)殖環(huán)境控制工程技術(shù)研究中心 河南省畜禽繁育與營養(yǎng)調(diào)控重點實驗室，鄭州 450002）

凝集素（Lectin）的生物學功能多樣，是一種可以與糖發(fā)生特定的和可逆結(jié)合的蛋白質(zhì)［1］。目前大量研究表明，Lectin能起到抗菌和消炎的作用［2-4］，并且Lectin和抗菌肽都被定性為免疫因子［5］。Lectin的數(shù)量龐大，結(jié)構(gòu)多樣，被發(fā)現(xiàn)在許多生物體內(nèi)，包括微生物，植物和動物［6］。根據(jù)其結(jié)構(gòu)和功能特征可以把凝集素分為R 型、L 型、P 型、C 型、I 型和 S 型等多種類型［7］。

C型凝集素（C-type lectin）代表一個識別碳水化合物配體依賴于鈣離子（Ca2+）參與的糖原結(jié)合蛋白家族，含有一個或多個一級結(jié)構(gòu)和二級結(jié)構(gòu)同源的碳水化合物識別結(jié)構(gòu)域［8-9］，是內(nèi)吞作用的受體，主要表達在巨噬細胞和內(nèi)皮細胞。C-type lectin能識別大量的糖基質(zhì)配體，其在細菌，真菌，病毒感染的細胞，和寄生蟲里都有發(fā)現(xiàn)［10］。同時C-type lectin在免疫方面也發(fā)揮重要的作用，如C-type lectin能識別多種致病菌并且誘導細胞因子的分泌［11］。目前，已經(jīng)有 1 000 多個C-type lectin被相繼鑒定。

家蠅（Musca domestica L.）普遍存在并且攜帶至少100種人類和動物疾?。?2］，然而他們能快速繁殖生長且自身不會引起疾病感染，所以家蠅必定具有完善而高效的免疫防御機制，是人們研究天然抗炎物質(zhì)的重要資源。家蠅Lsa（NCBI序列號：XP_00-5178145）（lectin subunit alpha）蛋白，有181個氨基酸，其中29到146位編碼C-type lectin（CTL）/C-type lectin-like（CTLD）。然而，目前國內(nèi)外對于家蠅Lsa蛋白抗炎活性及其細胞通路的研究還較少。

試驗旨在研究家蠅Lsa蛋白在金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）刺激下的抗炎活性。首先擴增Lsa基因，構(gòu)建在pLEX載體上，制備成慢病毒后，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染到RAW264.7細胞中，并通過轉(zhuǎn)染PLEX載體作為陰性對照，通過S. aureus刺激細胞后，收集不同時間點細胞及其上清，對不同時間點細胞提取RNA，反轉(zhuǎn)錄后用實時定量PCR的方法檢測 TNF-α、IL-1β、NF-κB-1、NF-κB-2 的 mRNA 相對轉(zhuǎn)錄水平，通過ELISA檢測細胞上清中的TNF-α和IL-1β，通過與陰性對照細胞相比，分析家蠅Lsa蛋白的抗炎活性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 載體、菌種及細胞 家蠅幼蟲由河南省疾病控制中心提供；pMD20-T 載體購自 TaKaRa 公司；pLEX慢病毒表達載體及其包裝質(zhì)粒（psPAX2）和包膜質(zhì)粒（pMD2.G）購自 GE公司；DH5α 感受態(tài)細胞購自北京天根公司；用于生產(chǎn)慢病毒的293T細胞和RAW264.7細胞購自ATCC公司；ELISA試劑盒購自達科為公司；S. aureus ATCC 25923購自ATCC公司。

1.1.2 主要試劑和培養(yǎng)基 限制酶Xho I和Age I購自Thermo公司，Trizol 試劑和 LipofectamineTM2000試劑購自 Invitrogen 公司，聚凝胺（Polybrene）和嘌呤霉素（Puromycin）試劑購自SIGMA公司，DMEM培養(yǎng)基和Opti-MEM?培養(yǎng)基購自Gibco公司，胎牛血清購自SeraPro公司，HA 抗體購自北京天根公司，熒光二抗購自 LI-COR 公司，SYBR Premix Ex Taq購自TaKaRa 公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取及cDNA合成 家蠅三齡幼蟲充分研磨后，參照Invitrogen公司的TRIzol?Reagent（Cat.No：15596-018）說明書并做適當改進操作。隨后取2 μL進行1%凝膠電泳檢測RNA的完整性，隨后用核酸定量儀分別測定樣品在260 nm，280 nm波長上的光密度，初步估算RNA的純度和濃度。檢測結(jié)果良好后，取1 μg 總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.2.2 Lectin subunit alpha基因表達載體的克隆與構(gòu)建 根據(jù)家蠅Lsa基因的mRNA序列信息（XM_005178088.3），設計基因引物，引物分別引入Xho I和Age I酶切位點，下劃線部分為 HA 標簽序列（表1）。以家蠅幼蟲cDNA為模板，進行PCR擴增，PCR反應條件為：95℃ 預變性 5 min；95℃變性 30 s，65℃（降低 2℃/2循環(huán)）退火 40 s 以及72℃延伸 100 s，共 16 個循環(huán)；然后 95℃變性 30 s，51℃退火 40 s 以及72℃延伸 100 s 共 19 個循環(huán)；最后 72℃延伸5 min，瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR產(chǎn)物和pLEX載體用Xho I和Age I雙酶切，連接轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細胞中。酶切和測序驗證正確的重組質(zhì)粒命名為pLEX-Lsa。

1.2.3 Lsa重組慢病毒的制備 使用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染pLEX-Lsa到293T細胞中。接種293T細胞于10-cm細胞培養(yǎng)皿中，并且在含10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，直到細胞生長到匯合度達到 70%-80%。稀釋 12 μg pLEX-Lsa，9 μg的包裝質(zhì)粒（psPAX2）和3.5 μg的包膜質(zhì)粒（pMD2.G）在1.5 mL Opti-MEM?培養(yǎng)基中，輕輕混勻。LipofectamineTM2000在使用前混勻，然后添加50 μL LipofectamineTM2000到1.5 mL Opti-MEM?培養(yǎng)基中。室溫孵育5 min后，混勻含pLEX-Lsa培養(yǎng)基和含LipofectamineTM2000培養(yǎng)基（總體積 3 mL），之后室溫孵育20 min。添加到293T細胞中，4 h更換新鮮培養(yǎng)基，24 h 后收獲含病毒的細胞培養(yǎng)上清，分裝保存于-70℃?zhèn)溆?。以上述同樣的方法生產(chǎn)包含空pLEX載體的慢病毒。1.2.4 重組慢病毒轉(zhuǎn)染RAW264.7細胞 在六孔板

中培養(yǎng)RAW264.7 細胞，在感染日達到60-70% 的匯合度。重組慢病毒與新鮮培養(yǎng)基各1 mL，同時加入聚凝胺（Polybrene）2 μg，到RAW264.7 細胞中。24 h后更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。添加嘌呤霉素（Puromycin）到RAW264.7 細胞中，通過不同濃度的不斷篩選，且終濃度為4 μg/mL，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的包含pLEX-Lsa的RAW264.7 細胞，被命名為RAW-pLEX-Lsa；包含空pLEX載體的RAW264.7 細胞，被命名為RAW-pLEX，作為陰性對照。

1.2.5 Western blot分析 分別收集RAW-pLEX-Lsa和RAW-pLEX細胞，裂解后取40 μg的總蛋白按文獻［13］進行 Western blotting 分析。40 μg總蛋白被分離通過SDS-PAGE電泳，然后被轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（NC膜），并將其與電轉(zhuǎn)裝置配套的海綿墊放到轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡10 min。NC膜被封閉液封閉2 h，一抗為小鼠源Anti-HA antibody，在室溫下孵育1-2 h，二抗為熒光素標記羊抗鼠IgG，室溫下孵育1 h。

1.2.6 S. aureus刺激RAW-pLEX-Lsa和RAW-pLEX細胞 在六孔板中分別培養(yǎng)RAW-pLEX-Lsa和RAW-pLEX細胞。在37℃的LB中孵育S. aureus，生長到對數(shù)期收集菌液。通過梯度稀釋和平板涂布的方法檢測S. aureus的活菌數(shù)。S. aureus刺激RAW-pLEX-Lsa和RAW-pLEX細胞，MOI為10∶1（細菌：細胞）。分別收集未刺激和刺激3 h，6 h，12 h 和24 h細胞，且收集未刺激和刺激6 h細胞上清，在每個時間點分別設置兩個平行樣品。

1.2.7 RT-PCR標準曲線的制備 使用絕對定量法構(gòu)建標準曲線，對S. aureus刺激的RAW-pLEX-Lsa和RAW-pLEX細胞的基因mRNA表達水平進行定量分析。根據(jù)小鼠（Mus musculus）NCBI序列信息，分別設計相應的跨內(nèi)含子引物。小鼠TNF-α基因有兩個轉(zhuǎn)錄剪接體，分別設計引物，命名為TNF-α-tv-1（NCBI序列號：NM_013693.3）和 TNF-α-tv-2（NCBI序列號：NM_001278601.1）。小鼠IL-1β基因有兩個轉(zhuǎn)錄剪接體，分別是IL-1β和IL-1β-X1，分別設計兩個引物，其中一個能體現(xiàn)兩個轉(zhuǎn)錄剪接體總的mRNA表達水平，另外一個是IL-1β轉(zhuǎn)錄剪接體的引物，分別命名為 IL-1β-T（NCBI序列號：XM_006498795.3）和IL-1β（NCBI序列號 ：NM_008361.4）。小鼠 NFκB-1（NCBI序列號 ：NM_008689），NFκB-2（NCBI序列號：XM_006526743.3）和 GAPDH（NCBI序列號：NM_008084.3）基因，分別設計引物。所有引物序列見表1。

表1 基因克隆及定量RT-PCR檢測的引物序列

1.2.8 RNA的提取及實時定量RT-PCR 用Trizol提取RAW-pLEX-Lsa和RAW-pLEX細胞總mRNA，取1 μg 總 RNA 反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA，取 2 μL cDNA 進行實時定量RT-PCR，GAPDH基因為內(nèi)參基因。反應體系 ：cDNA 2 μL；SYBR Premix Ex Taq 5 μL；上下游引物（10 pmol/L）各1 μL；無 RNA 酶超純水 補至 10 μL。反應程序為 ：95℃ 10 min，45 個循環(huán) ：95℃ 10 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s。溶解曲線 ：95℃10 s，65℃ 60 s，97℃ 1 s，降溫至 37℃ 30 s。每個樣本重復 3 次。

1.2.9 ELISA檢測細胞炎性細胞因子的蛋白水平 分別用TNF-α和IL-1β的ELISA試劑盒，檢測未刺激和S. aureus刺激6 h后細胞上清中TNF-α和IL-1β的蛋白水平，用酶標儀讀取數(shù)值。

1.2.10 統(tǒng)計分析 使用SPSS 22軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析（One-way ANOVA）和鄧肯檢驗（Duncana test）。

2 結(jié)果

2.1 Western blotting的檢測結(jié)果

通過HA 抗體進行Western blotting分析，檢測Lsa在RAW264.7細胞中的表達。結(jié)果（圖1）顯示，有特異性條帶在21 kD標準分子量附近，表明Lsa在RAW264.7細胞中穩(wěn)定表達。

圖1 Western blotting檢測蛋白Lsa的表達

2.2 S. aureus刺激前后TNF-α-tv-1和TNF-α-tv-2的相對轉(zhuǎn)錄水平

在S. aureus 刺激后，RAW-pLEX-Lsa和RAW-pLEX細胞中，TNF-α-tv-1和TNF-α-tv-2基因的相對轉(zhuǎn)錄水平均迅速升高，6 h達到最高峰，隨后下降。RAW-pLEX-Lsa細胞中TNF-α-tv-1基因的相對轉(zhuǎn)錄水平在6 h相比RAW-pLEX細胞顯著下調(diào)（P＜0.05）。RAW-pLEX-Lsa細胞中TNF-α-tv-1基因的相對轉(zhuǎn)錄水平在12 h相比RAW-pLEX細胞明顯低于RAW-pLEX細胞（P＞0.05）。RAW-pLEX-Lsa細胞中TNF-α-tv-2基因的相對轉(zhuǎn)錄水平在6 h和12 h相比RAW-pLEX細胞顯著下調(diào)（P＜0.05）。隨著時間點的變化，RAW-pLEX-Lsa和 RAW-pLEX細 胞 中 TNF-αtv-1和TNF-α-tv-2基因的相對轉(zhuǎn)錄水平趨勢都基本一致。在RAW-pLEX細胞中，TNF-α-tv-1基因的相對轉(zhuǎn)錄水平在6 h是TNF-α-tv-2基因的相對轉(zhuǎn)錄水平的45倍，此時與其他各個時間點相對轉(zhuǎn)錄水平相比，TNF-α-tv-1基因的相對轉(zhuǎn)錄水平是TNF-α-tv-2基因的相對轉(zhuǎn)錄水平的最小倍數(shù)。在RAW-pLEXLsa細胞中，TNF-α-tv-1基因的相對轉(zhuǎn)錄水平在3 h是TNF-α-tv-2基因的相對轉(zhuǎn)錄水平的57倍，此時與其他各個時間點相對轉(zhuǎn)錄水平相比，TNF-α-tv-1基因的相對轉(zhuǎn)錄水平是TNF-α-tv-2基因的相對轉(zhuǎn)錄水平最小倍數(shù)（圖2-A、B）。在S. aureus 刺激6 h后，ELISA檢測細胞上清中TNF-α蛋白水平，RAW-pLEX-Lsa細胞上清中的TNF-α蛋白水平顯著低于RAW-pLEX細胞上清中的TNF-α蛋白水平（P＜0.05）（圖2-C）。

圖2 S. aureus刺激前后RAW-pLEX-Lsa和RAW-pLEX細胞中 TNF-α-tv-1（A）和 TNF-α-tv-2（B）的mRNA的表達量和TNF-α（C）的產(chǎn)量

2.3 S. aureus刺激前后IL-1βT和IL-1β的相對轉(zhuǎn)錄水平

在S. aureus 刺激后，RAW-pLEX-Lsa和RAW-pLEX細胞中IL-1βT 和 IL-1β基因的相對轉(zhuǎn)錄水平均迅速升高，6 h達到最高峰，隨后下降。RAW-pLEX-Lsa細胞中IL-1βT基因的相對轉(zhuǎn)錄水平在3 h，6 h和12 h相比RAW-pLEX細胞顯著下調(diào)（P＜0.05）。RAW-pLEX-Lsa細胞中IL-1β基因的相對轉(zhuǎn)錄水平在3 h和6 h相比RAW-pLEX細胞顯著降低（P＜0.05）。隨著時間點的變化，RAW-pLEX-Lsa和RAW-pLEX細胞中 IL-1βT 和 IL-1β基因的相對轉(zhuǎn)錄水平趨勢都基本一致。在RAW-pLEX細胞中，IL-1βT基因的相對轉(zhuǎn)錄水平在3 h，6 h和12 h分別是IL-1β基因的相對轉(zhuǎn)錄水平的19，20，57倍。在RAW-pLEX-Lsa細胞中，IL-1βT基因的相對轉(zhuǎn)錄水平在3 h，6 h和12 h分別是IL-1β基因的相對轉(zhuǎn)錄水平的22，18，23倍（圖3）。ELISA檢測細胞上清中IL-1β的蛋白水平，在RAW-pLEX細胞上清中，S. aureus刺激6 h后，上清中IL-1β的蛋白水平為46 pg/mL，未刺激的細胞上清中IL-1β的蛋白水平未檢測到；RAW-pLEX-Lsa細胞上清中，IL-1β的蛋白水平在刺激前和刺激后均未檢測到。

圖3 S. aureus刺激前后RAW-pLEX-Lsa和RAW-pLEX細胞中IL-1βT和IL-1β的mRNA的表達量

2.4 S. aureus刺激前后NFκB-1和NFκB-2的相對轉(zhuǎn)錄水平

在S. aureus 刺激后，RAW-pLEX-Lsa和RAW-pLEX細胞中NFκB-1基因的相對轉(zhuǎn)錄水平均迅速升高，6 h達到最高峰，隨后下降。RAW-pLEX-Lsa細胞中NFκB-1基因的相對轉(zhuǎn)錄水平在各個時間點與RAW-pLEX細胞相比無顯著差別（圖4）。

圖4 S. aureus刺激前后RAW-pLEX-Lsa和RAW-pLEX細胞中NFκB-1的mRNA的表達量

在S. aureus 刺激后，RAW-pLEX-Lsa和RAW-pLEX細胞中NFκB-2基因的相對轉(zhuǎn)錄水平均迅速升高，3 h達到最高峰，隨后下降。RAW-pLEX-Lsa細胞中NFκB-2基因的相對轉(zhuǎn)錄水平在3 h與RAW-pLEX細胞相比顯著升高（P＜0.05）（圖5）。

3 討論

Dr. Alexander Ogston 發(fā)現(xiàn)S. aureus是重要的革蘭氏陽性菌［14］，并且能引起許多疾病。例如，皮膚及軟組織感染（SSTIs），肺炎，菌血癥，乳腺炎等［15-16］。另外S. aureus感染還會導致嚴重和持久的宿主炎癥反應［17-20］。S. aureus刺激巨噬細胞會引起炎性細胞因子的分泌（包括TNF-a和IL-1β）［21-23］，而在免疫效應細胞消除感染的第一階段炎性細胞因子有利于消除感染［24-25］，并且S. aureus刺激巨噬細胞能激活 NF-κB 信號通路［26］。

圖5 S. aureus刺激前后RAW-pLEX-Lsa和RAW-pLEX細胞中NFκB-2的mRNA的表達量

炎癥是臨床常見的病理過程，是機體對損傷因子的病理性防衛(wèi)反應，也是最重要的保護性反應。高表達量的炎性細胞因子是炎性病變的重要特征之一［27］。TNF-α參與激活中性粒細胞，損傷內(nèi)皮細胞，和加劇炎癥級聯(lián)反應［28-29］。根據(jù)NCBI上的小鼠基因序列信息發(fā)現(xiàn)TNF-α有兩個轉(zhuǎn)錄剪接體。轉(zhuǎn)錄剪接體2與轉(zhuǎn)錄剪接體1相比，缺少外顯子3片段，有48個堿基，16個氨基酸。由圖2可知，在S. aureus刺激RAW264.7細胞引起的炎癥反應中，TNF-α-tv-1可能起到更重要的作用。在調(diào)節(jié)S. aureus引起的宿主免疫反應中，IL-1β是重要的促炎性細胞因子［30］。根據(jù)NCBI上的小鼠基因序列信息發(fā)現(xiàn)IL-1β 有轉(zhuǎn)錄剪接體 IL-1β-X1 和 IL-1β。IL-1β 與 IL-1β-X1相比，外顯子缺少1 302個堿基，434個氨基酸。由圖3可知，在S. aureus刺激RAW264.7細胞引起的炎癥反應中，IL-1β-X1可能起到更重要的作用。根據(jù)我們所查文獻，小鼠TNF-α和IL-1β轉(zhuǎn)錄剪接體的生物學功能，目前還未見報道。由圖2可知，在S. aureus刺激6 h后，RAW-pLEX-Lsa細胞上清中，TNF-α的蛋白水平顯著降低。在S. aureus刺激6 h后，ELISA檢測細胞上清中IL-1β的蛋白水平，在RAW-pLEX細胞上清中IL-1β的蛋白水平為46 pg/ml，RAW-pLEX-Lsa細胞上清中，IL-1β的蛋白水平未檢測到。結(jié)果表明，在RAW264.7細胞中穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的家蠅Lsa蛋白能夠抑制TNF-α和IL-1β的轉(zhuǎn)錄和生產(chǎn)。

研究報道，N-乙酰氨基葡萄糖lectin擁有抗炎活性，能減少由炎癥引起的TNF-α的表達量［31］。Shan等［32］在 2013年發(fā)現(xiàn)，小腸黏液包含galectin-3，Dectin-1 和 FcgRIIB，可以抑制 NFκB 調(diào)節(jié)的促炎因子基因的表達。Freitas 等［33］發(fā)現(xiàn)酵母聚糖誘導的顳下頜關(guān)節(jié)組織和三叉神經(jīng)節(jié)中，秋葵（Abelmoschus esculentus）Lectin可以減少TNF-a和IL-1β的表達量。Jin等［34］發(fā)現(xiàn)一個新型的的肽（GC31），來自血栓調(diào)節(jié)蛋白的C型凝集素樣結(jié)構(gòu)域，在RAW264.7細胞中發(fā)揮抗炎性能通過阻塞LPS激活的NFκB信號通路，進而抑制TNF-a 和 IL-6的表達。Matsumoto等［35］發(fā)現(xiàn)可溶性唾液酸結(jié)合免疫球蛋白型凝集素9（sSiglec-9）通過抑制NFκB信號通路的活性，進而減少促炎性細胞因子（TNF-a 和IL-6）的表達。在S. aureus刺激后，RAW-pLEX與RAW-pLEX-Lsa相比，RAW-pLEX-Lsa細胞中TNF-α和IL-1β基因的相對轉(zhuǎn)錄水平顯著下降，而NFκB-1與NFκB-2基因的相對轉(zhuǎn)錄水平并沒有呈現(xiàn)下降趨勢。因此，我們認為在RAW264.7細胞中穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的家蠅Lsa蛋白并不是通過抑制NFκB信號通路的活性，進而顯著地抑制TNF-α和IL-1β的轉(zhuǎn)錄和生產(chǎn)，而可能是通過其他通路影響炎性細胞因子的表達。

4 結(jié)論

家蠅Lsa蛋白可以有效地發(fā)揮抗炎活性，抑制TNF-α和IL-1β的表達。

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