一株解淀粉芽孢桿菌生防蛋白的鑒定及分析

郭繼平 馬光 王志杰 齊善厚 王寶梅 蘇長青，2

（1. 衡水學(xué)院生命科學(xué)系，衡水 053000；2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所，北京 100193；3. 寶雞市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，寶雞 722400）

葡萄霜霉病是一種世界性的主要葡萄病害，是由專性活體營養(yǎng)寄生卵菌Plasmopara viticola造成的［1］。在過去的20年中，普遍使用銅化合物和化學(xué)農(nóng)藥來防治葡萄霜霉病，這導(dǎo)致了重金屬積累和農(nóng)藥殘留問題［2］。為解決這一問題，銅殺菌劑和化學(xué)農(nóng)藥在有機農(nóng)業(yè)中的使用限制越來越嚴(yán)格。近年來，研究人員大力替代產(chǎn)品，以減少或消除葡萄生產(chǎn)中的銅基配方和化學(xué)農(nóng)藥的使用［1］。一些研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的天然化合物，表明在葡萄霜霉病防治方面有較好的效果，如蛋白水解物［3］、殼聚糖［4］、海帶多糖［5］、微生物［6］。

解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）是可用于生物防治的重要生防菌之一。其作用機理主要包括分泌抗菌物質(zhì)、產(chǎn)生拮抗作用、營養(yǎng)與空間的競爭及誘導(dǎo)寄主產(chǎn)生抗性和促進(jìn)植物生長等［7］。解淀粉芽孢桿菌分泌的抗菌物質(zhì)主要是低分子量的抗生素以及抗菌蛋白或多肽等活性物質(zhì)［8］。解淀粉芽孢桿菌菌株合成的幾丁質(zhì)酶［9］、抗真菌肽［10-11］，已經(jīng)被證明是有效的抑菌蛋白，對葡萄病害有明顯的防控效果。從葡萄木質(zhì)組織中分離到的內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌AG1，已被證明是有效的真菌生物防治劑［12］。在對抗菌蛋白的鑒定中，蛋白質(zhì)組學(xué)得到了廣泛的應(yīng)用。蛋白質(zhì)組學(xué)是分離蛋白質(zhì)復(fù)合物，研究蛋白功能的一個有力的工具，成為功能基因組學(xué)策略的重要組成部分［13］。在前期的研究中，本實驗室篩選到一株解淀粉芽孢桿菌，其發(fā)酵菌液對葡萄霜霉病有抑制作用。為研究其發(fā)酵液蛋白組成，本研究采用蛋白質(zhì)譜方法對篩選到的解淀粉芽孢桿菌在NA液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)時分泌到培養(yǎng)基中的分泌蛋白進(jìn)行鑒定，并對鑒定到的蛋白采用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法進(jìn)行分析，以期發(fā)現(xiàn)該菌株分泌的與生物防治相關(guān)的蛋白。

1 材料與方法

1.1 材料

葡萄霜霉病拮抗解淀粉芽孢桿菌N22由衡水學(xué)院微生物學(xué)實驗室從葡萄葉片表面分離并保存。

1.2 方法

1.2.1 解淀粉芽孢桿菌的發(fā)酵培養(yǎng) 將培養(yǎng)好的斜面解淀粉芽孢桿菌N22接入NA液體培養(yǎng)基中，28℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)72 h得發(fā)酵液后備用。NA液體培養(yǎng)基配方：10 g胰蛋白胨，3 g牛肉浸膏，5 g氯化鈉，1 000 mL蒸餾水，1×105Pa，121℃滅菌15 min。

1.2.2 細(xì)菌培養(yǎng)液的SDS-PAGE 將解淀粉芽孢桿菌N22發(fā)酵液，12 000 r/min離心5 min，取上清液。1 mL上清液加入100 μL 三氯乙酸（濃度為100%），-20℃放置30 min，12 000 r/min離心10 min，棄上清，加入1 mL 4℃預(yù)冷的丙酮，混勻離心，洗滌2次，干燥后加入一定量的0.1 mol/L NaOH溶解沉淀。處理好的樣品采用SDS-PAGE確認(rèn)蛋白純度和大小。分離膠濃度為12%，濃縮膠濃度為5%，以低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，SDS-聚丙烯酰胺凝膠凝膠電泳方法參照《蛋白質(zhì)技術(shù)手冊》［14］進(jìn)行。

1.2.3 蛋白質(zhì)譜鑒定樣品的處理 切下需要分析的膠點，放入干凈的1.5 mL離心管中，編號。在每個離心管內(nèi)加入1 mL水，清洗10 min，將水移除，重復(fù)一次。在每個離心管中加入1 mL膠內(nèi)消化脫色液，清洗10 min，將脫色液移除，重復(fù)一次。膠內(nèi)消化脫色液的配置：50%乙腈，25 mmol/L 碳酸氫銨。加入乙腈脫水至膠粒完全變白，真空抽干乙腈。加10 mmol/L DTT，讓膠粒吸收完全，放入56℃水浴鍋內(nèi)，孵育1 h。孵育完畢后，移除多余DTT液體，加入55 mmol/L IAM，暗室室溫孵育45 min。孵育完畢后，移除多余IAM液體，加入25 mmol/L 碳酸氫銨，清洗10 min，并重復(fù)清洗一次。移除碳酸氫銨，加入脫色液清洗10 min，并重復(fù)一次。乙腈脫水至膠粒完全變白，真空抽干乙腈。1 μg/μL的酶儲液以25 mmol/L 碳酸氫銨稀釋15倍，加入脫水后的膠粒中，讓膠粒充分吸收。然后加入25 mmol/L碳酸氫銨沒過膠粒，37℃水浴鍋消化過夜。加入終濃度0.1%的FA終止消化。取10 μL樣品上機，質(zhì)譜儀檢測。

2 結(jié)果

2.1 分泌蛋白的提取和鑒定

2.1.1 分泌蛋白的SDS-PAGE 本研究將解淀粉芽孢桿菌的培養(yǎng)液去菌體，濃縮后上樣，進(jìn)行SDSPAGE電泳，結(jié)果如圖1所示。通過電泳結(jié)果可見，解淀粉芽孢桿菌在NA液體培養(yǎng)基中可分泌多種蛋白質(zhì)，分泌蛋白量最大的部分集中在相對分子量35-40 kD之間。

圖1 解淀粉芽孢桿菌分泌蛋白質(zhì)的SDS-PAGE電泳圖

2.1.2 蛋白鑒定中各肽段得分分布 如圖2所示，斜線陰影區(qū)域部分是顯著性閾值。得分超過此區(qū)域的結(jié)果，為Mascot指認(rèn)的陽性結(jié)果。得分以-log10（P）計算，P為概率。本研究中結(jié)果顯示肽段得分＞22的為鑒定蛋白可信（P＜0.05）。

圖2 蛋白質(zhì)譜中肽段得分分布

2.1.3 分泌蛋白的種類 本研究中的解淀粉芽孢桿菌的發(fā)酵液中共可以鑒定到53個蛋白（表1）。其中酶類共有22個，占41.51%，這22種酶類中有轉(zhuǎn)移酶類5個，占蛋白總數(shù)的9.43%；氧化還原酶類7個，占蛋白總數(shù)的13.21%；水解酶類10個，占蛋白總數(shù)的18.87%。除酶類外結(jié)合蛋白共有18個，占蛋白總數(shù)的33.96%；功能蛋白13個，占蛋白總數(shù)的24.53%。

2.1.4 分泌蛋白的相對分子量分布 對鑒定到的53個蛋白的相對分子量進(jìn)行統(tǒng)計分析，結(jié)果（圖3）表明，53個蛋白的相對分子量最小的為8.75 kD（G2TRL2：Histone-fold domain-containing protein new1），最大的為373.99 kD（Q756G2：Probable E3 ubiquitin-protein ligase TOM1）。共42個蛋白的相對分子量分布在0-100 kD之間，10個分布在100-200 kD之間，1個＞300 kD。

2.1.5 分泌蛋白的功能分類 通過對鑒定到的53個蛋白的基本功能進(jìn)行統(tǒng)計分析（表2）發(fā)現(xiàn)，除10個結(jié)構(gòu)蛋白外，其他43個蛋白分別與解淀粉芽孢桿菌的多個生理生化過程有關(guān)。其中最多的是碳水化合物代謝相關(guān)蛋白，為10個，占19%；其他如能量代謝、蛋白質(zhì)代謝、核酸代謝、脂類代謝以及其他代謝涉及蛋白共18個。參與信號傳遞和物質(zhì)運輸?shù)牡鞍追謩e為6個和5個。防御蛋白一個，占2%。

2.2 分泌蛋白的go富集分析

為研究所鑒定的分泌蛋白的在解淀粉芽孢桿菌中行使的具體功能，對鑒定到的53個蛋白進(jìn)行了基因本體論分析（GO分析）。結(jié)果（圖4）表明本研究中鑒定到的53個蛋白質(zhì)主要參與了解淀粉芽孢桿菌的糖代謝過程、脂類代謝過程、己糖代謝過程、單一碳水化合物代謝過程、單糖代謝過程、碳水化合物代謝過程、能量代謝過程、非生物刺激反應(yīng)、氧化還原過程、氨基酸代謝過程。同時作為細(xì)胞組分參與核酸組成、膜結(jié)構(gòu)、細(xì)胞骨架、細(xì)胞壁的組成。還有的行使RNA結(jié)合蛋白、核酸合成與修復(fù)、DNA結(jié)合蛋白的分子功能。

2.3 分泌蛋白的KEGG通路顯著性富集分析

基于蛋白質(zhì)參與生化過程的KEGG分析，能夠分析蛋白質(zhì)在生物體中參與的各種信號途徑和生理生化過程。通過對本研究鑒定到的53個蛋白進(jìn)行KEGG分析（表3）表明，鑒定到的蛋白主要是參與各個代謝過程。其中，參與代謝途徑的為13個，占24.53%，其他還有參與氮代謝、糖代謝、脂肪代謝、丙酮酸代謝的等等。另外還有參與磷脂酰肌醇信號系統(tǒng)的，參與基因表達(dá)調(diào)控的基本轉(zhuǎn)錄因子、RNA降解、DNA合成等。植物-病原互作的蛋白發(fā)現(xiàn)了6個，占11.32%，這些蛋白在解淀粉芽孢桿菌的生物防治研究中具有較大的研究價值。

3 討論

多年來，芽孢桿菌已被廣泛應(yīng)用于植物病害生物防治、工業(yè)酶生產(chǎn)和抗生素生產(chǎn)。芽孢桿菌產(chǎn)生多種抗菌物質(zhì)，包括揮發(fā)物，脂肽［15］和幾種改性小肽和蛋白質(zhì)［16-17］，近年來，對于解淀粉芽孢桿菌中的抑菌蛋白的研究成為生物防治的一個研究熱點。

本實驗采用的我們前期的研究篩選到的解淀粉芽孢桿菌菌株，對葡萄霜霉病有很好的控制效果，其發(fā)酵液中的蛋白成分有明顯的抑菌效果。參考前人研究［18］，采用SDS電泳切膠后進(jìn)行質(zhì)譜鑒定分析蛋白，避免培養(yǎng)基干擾。研究發(fā)現(xiàn)在NA液體培養(yǎng)基培養(yǎng)的條件下，該解淀粉芽孢桿菌分泌的蛋白質(zhì)中除維持本身結(jié)構(gòu)和生理生化過程的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白、轉(zhuǎn)運蛋白、參與基因調(diào)控的蛋白質(zhì)等蛋白外，還有6個被推定為植物與病原互作的蛋白。其中蛋白質(zhì)C7Z83和A6SDE被推定為屬于氨基肽酶蛋白家族。氨基肽酶是一種外肽酶，在微生物、植物、動物中都廣泛存在。前人的研究表明它參與對病原菌的抗性過程。它作用于蛋白質(zhì)的N末端打開多肽鏈［19］。在香蕉枯萎病的生物防治的研究中發(fā)現(xiàn)，一株海洋細(xì)菌TC-1中表達(dá)的氨基肽酶對于病菌具有抑制作用［20］。對番茄的研究發(fā)現(xiàn)，番茄受創(chuàng)傷的后期，亮氨酸氨基肽酶在相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起作用［21］。細(xì)菌性斑點病菌會誘導(dǎo)番茄中氨基肽酶蛋白家族基因的激活表達(dá)，參與番茄對病菌的抗性［22］。另外4種是參與幾丁質(zhì)代謝過程的乙酰葡糖胺磷酸變 位 酶（Q09770：Phosphoacetylglucosamine mutase 2）、乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶（Q9UQW6：Acetyl-CoA acetyltransferase）、UDP-N-乙酰葡萄糖胺（Q8SQS1：UDP-N-acetylglucosamine）及幾丁質(zhì)酶（P29465：Chitinase ChiA）均被判定為參與植物與病原互作過程。幾丁質(zhì)是N-乙酰葡糖胺通過β連接聚合而成的結(jié)構(gòu)同多糖，是自然界中豐富存在的多糖。它是真菌細(xì)胞壁和昆蟲的外骨骼的主要結(jié)構(gòu)成分［23-24］。幾丁質(zhì)酶可分解幾丁質(zhì)，可產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶的生物很多，包括是動物、植物、昆蟲、真菌和細(xì)菌。在酵母中，如釀酒酵母，幾丁質(zhì)酶在促進(jìn)細(xì)胞高效分離方面起到了形態(tài)學(xué)作用［25］。植物表達(dá)幾丁質(zhì)酶防御有甲殼素作為一個結(jié)構(gòu)成分的病原體。細(xì)菌產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶主要用于降解幾丁質(zhì)作為碳源和能源［26］。幾丁質(zhì)酶產(chǎn)生菌已被報道作為不同種類真菌的生物防治劑。Driss等［27］發(fā)現(xiàn)Bacillus thuringiensis的含有幾丁質(zhì)酶的上清液對Aspergillus niger具有較高的抗真菌活性。研究發(fā)現(xiàn)，28-9蠟樣芽孢桿菌產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶對灰霉病菌具有明顯的抑制作用［28］。de la Vega等［29］研究報道，來自于Bt. subsp. aizawai純化的66 kD的幾丁質(zhì)酶，可破壞6種植物病原真菌的細(xì)胞壁，能抑制Fusarium sp. 和 Sclerotium rolfsii的菌絲生長。此外，兩株真菌產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶可以降解Fusarium solani的細(xì)胞壁，并抑制其分生孢子的萌發(fā)［30］。本研究中采用的對葡萄霜霉病具有生防作用的解淀粉芽孢桿菌可以產(chǎn)生與幾丁質(zhì)代謝相關(guān)蛋白，從一個方面說明了該菌株防治葡萄霜霉病的機制，這也是下一步研究其應(yīng)用的一個突破口。

表1 蛋白質(zhì)譜鑒定到的蛋白種類

圖3 分泌蛋白的相對分子量分布

表2 分泌蛋白的功能分類

圖4 分泌蛋白的GO富集分析

表3 分泌蛋白KEGG通路顯著性分析

4 結(jié)論

本研究中從NA培養(yǎng)基中培養(yǎng)的一株生防解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵液中篩選到53種蛋白質(zhì)。其中除包含參與細(xì)胞構(gòu)成以及能量和物質(zhì)代謝的47種蛋白質(zhì)外，還有6種蛋白質(zhì)參與植物與病原菌互作的蛋白，2種屬于氨基肽酶家族，其他4種（包含幾丁質(zhì)酶在內(nèi)）參與幾丁質(zhì)的代謝過程。氨肽酶和幾丁質(zhì)酶已經(jīng)被證明具有生物防治作用。

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