桂花OfLCYB和OfLCYE啟動子的克隆和活性分析

沈子又 張超 董彬 付建新 胡紹慶 趙宏波

（1. 浙江農林大學風景園林與建筑學院，臨安 311300；2. 浙江理工大學建筑工程學院，杭州 310018）

類胡蘿卜素是由異戊二烯骨架構成的C40或C30萜類化合物，是一類重要的天然色素的總稱，在可見光下呈紅色、橙色或黃色［1］，是果實和花的重要呈色物質之一。番茄紅素環(huán)化是類胡蘿卜素代謝中的一個重要分支點，植物中存在兩種番茄紅素環(huán)化酶（LCYB和LCYE）。LCYB能對稱地催化番茄紅素兩端各生成1個β環(huán)，只有一端被環(huán)化時，生成γ-胡蘿卜素，另一端進一步被環(huán)化后則生成β-胡蘿卜素；LCYE僅能催化番茄紅素的一端生成ε環(huán)，即δ-胡蘿卜素，另一端再由LCYB進一步催化生成α-胡蘿卜素［2］。氨基酸序列分析表明擬南芥中的LCYB和LCYE同源性為36%，可能有共同的起源［3］。LCYB和LCYE基因表達的相對水平決定了下游由β-胡蘿卜素代謝生成的β-隱黃質、玉米黃質、新黃質以及由α-胡蘿卜素代謝生成的α-隱黃質和葉黃素等在類胡蘿卜素總量中的比例［4-5］。果實中有大量的類胡蘿卜素積累，目前克隆出的LCYB和LCYE基因大多為果實和作物中分離出來的。在番茄果實中克隆得到番茄紅素 -β-環(huán)化酶 -CrtL-b（LCYB）［6］、番茄紅素 -ε-環(huán)化酶 -CrtL-e（LCYE）［7］；玉米中克隆和鑒定的LCYB和LCYE基因［8-9］；甘薯中分離出了 LCYE 基因［10］和 LCYB 基因等［11］。

桂花（Osmanthus fragrans Lour.）隸屬于木犀科木犀屬（Osmanthus），是我國十大傳統(tǒng)名花之一，也是重要的園林綠化樹種。根據開花特性不同，可分為秋桂和四季桂，秋桂品種按照花色不同又分為金桂品種群（黃色至金黃色系）、銀桂品種群（黃白色至黃色系）和丹桂品種群（橙色至橙紅色系）［12］。桂花花瓣中含有類黃酮化合物和類胡蘿卜素兩大類色素成分，在黃酮類化合物形成基本淺黃色系的基礎上，決定不同品種間花色變化的主要成分是類胡蘿卜素，且類胡蘿卜素種類及其含量的變化決定不同品種花色的差異［13］。前期研究發(fā)現(xiàn)，OfLCYB1、OfLCYE1等基因的差異表達決定了類胡蘿卜素代謝分支下游產物的含量。本研究克隆OfLCYB和OfLCYE基因啟動子序列，分析順式作用元件，構建其植物表達載體并進行瞬時表達分析，以期為明確OfLCYB和OfLCYE基因參與類胡蘿卜素代謝及其調控機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗材料為6-8年生的丹桂品種‘堰虹桂’（Osmanthus fragrans ‘Yanhong Gui’），種植于浙江農林大學桂花資源圃。

DNA限制性內切酶、LA Taq酶、核酸分子量標準（DNA marker ladder）、T4-DNA連接酶、克隆載體pMD18-T、大腸桿菌感受態(tài)DH5α以及瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、普通質粒小提試劑盒、In-Fusion HD Cloning Kit、XbaI和Hind Ⅲ等均購自TaKaRa公司，染色用X-gluc（5-溴-4-氯-3-吲哚基-beta-D-葡糖苷酸環(huán)己胺鹽）購于上海生工，pBI121由本實驗室保存，其他常規(guī)試劑采用進口分裝或國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 桂花啟動子的克隆及序列分析 基因組DNA的提取采用CTAB法［14］。根據‘堰虹桂’LCYB和LCYE基因序列設計引物，由生工生物工程（上海）有限公司合成（表1）。用限制性內切酶DraI、StuI、Pvu II和EcoR V分別對桂花基因組DNA進行酶切并連接接頭，進行巢式PCR擴增。第二輪反應模板為第一輪反應產物1 μL與49 μL ddH2O混合產物。50 μLPCR 反應體系為 ：模板 DNA 1 μL，AP1/AP2 1 μL，GSP1/GSP2 1 μL，10×La PCR buffer 5 μL，dNTP 5 μL，Mg2+3.75 μL，LA Taq 1 μL，ddH2O 32.5 μL。第一輪PCR反應條件為：94℃ 25 s，72℃ 3 min，7個循環(huán)；94℃ 25 s，67℃ 3 min，32個循環(huán)；67℃ 7 min。第二輪PCR反應條件為：94℃ 25 s，72℃ 3 min，5 個循環(huán) ；94℃ 25 s，67℃ 3 min，20個循環(huán)；67℃，7 min。PCR產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，切下目的條帶，使用凝膠回收試劑盒回收并純化。將純化產物與pMD18-T載體連接，再轉化DH5α感受態(tài)細胞，接種到含Amp（50 mg/L）的LB平板上37℃培養(yǎng)14-16 h，挑取單菌落進行PCR，測序。用Plantcare（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）對啟動子序列結果進行順式作用元件預測。

表1 啟動子克隆相關引物序列

1.2.2 OfLCYB和OfLCYE啟動子表達載體的構建 根據上述研究中克隆出的OfLCYB和OfLCYE啟動子設計引物（表2），使用In-Fusion HD Cloning Kit進行表達載體的構建。表達載體pBI121用XbaI和 Hind Ⅲ雙酶切，10 μL連接體系為2 μL 5× In-Fusion HD Enzyme Premix，2 μL pBI121 純化產物，6 μL目的片段。將連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞。挑取單菌落搖菌后進行PCR檢測，測序。

表2 啟動子表達載體相關引物

1.2.3 農桿菌介導的煙草轉化與瞬時表達 制備農桿菌感受態(tài)，將構建好的載體轉化到根癌農桿菌GV3101中［15］，將煙草葉片剪成切成0.5 cm×0.5 cm的葉塊，在農桿菌菌液濃度OD600為0.6的侵染液中浸染10 min，用無菌濾紙吸干葉片表面的菌液，將侵染的外植體移至于無菌水浸潤的濾紙上培養(yǎng)24 h并進行GUS染色，37℃下保溫16-24 h。用乙酸∶乙醇（3∶1）的混合液脫色后取出觀察染色結果［16］。

2 結果

2.1 OfLCYB和OfLCYE啟動子的克隆

以‘堰虹桂’基因組DNA為模板通過兩輪PCR擴增分別獲得OfLCYB和OfLCYE啟動子片段大約1 kb和900 bp（圖1）。將此片段回收，與pMD18-T載體連接，經菌落PCR驗證后，證明該啟動子片段已克隆到pMD18-T載體上。陽性克隆測序結果表明，OfLCYB序列長度為1 028 bp，OfLCYE序列長度904 bp。

2.2 OfLCYB和OfLCYE啟動子的序列分析

通過Plantcare對OfLCYB和OfLCYE啟動子進行序列分析發(fā)現(xiàn)，OfLCYB啟動子在起始密碼子上游-156 bp處發(fā)現(xiàn)核心元件TATA-box，且多處發(fā)現(xiàn)CAAT-box，同時還有光響應元件ACE、Box 4、GATT-motif、Sp1，脫落酸響應元件ABRE，赤霉素響應元件P-box，水楊酸響應元件TCA-element，高轉錄水平順式作用元件5' UTR Py-rich stretch，參與晝夜控制的順式作用調節(jié)元件circadian，MYB結合位點MBS以及防御和應激反應中的元件TC-rich repeats等（圖2）。OfLCYE啟動子中TATA-box位于起始密碼子上游-295 bp處，同時還有兩個光響應元件AE-box、G-box，赤霉素響應元件GARE-motif，水楊酸響應元件TCA-element，熱擊響應元件HSE，參與蛋白代謝調節(jié)的順式調控原件O2-site，厭氧誘導必需的調控元件ARE，胚乳表達所需的調控元件Skn-1_motif等（圖 3）。

圖1 ‘堰虹桂’OfLCYB（A）和OfLCYE（B）啟動子擴增圖譜

2.3 OfLCYB和OfLCYE啟動子的瞬時表達分析

構建OfLCYB和OfLCYE啟動子表達載體經菌落PCR鑒定準確無誤后命名為PBI121-LCYB、PBI121-LCYE。以煙草的葉為受體材料，以含pBI121載體的菌株為陽性對照，以GV3101空菌株為陰性對照，采用農桿菌介導的瞬時表達法對OfLCYB和OfLCYE啟動子表達特性進行分析。圖4顯示，在農桿菌侵染后的煙草葉片中除了GV3101外均檢測到GUS基因的產物，表明所克隆的桂花基因OfLCYB和OfLCYE啟動子序列具有啟動子功能，同時也表明這兩個啟動子均具有驅動下游GUS報告基因表達的能力。但由圖中結果可以看出，OfLCYB啟動子驅動報告基因在煙草葉片中只是少量表達（圖4-C）。

圖2 OfLCYB啟動子中相關順式作用元件預測分析

3 討論

目前在花中LCYB和LCYE基因已從菊花（Chrysanthemum moriflium）［17］、黃花龍膽（Gentiana lutea）［5］、金花茶（Camellia nitidissima）［18］、鶴望蘭（Strelitzia reginae）［19］等植物中分離出來。‘堰虹桂’花瓣中的類胡蘿卜素主要為α-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素。對類胡蘿卜素合成途徑中的相關基因進行qRT-PCR分析，在鈴梗期到初開期的過程中OfLCYE表達量上升，到盛開期下降［20］。

植物啟動子在調控基因表達過程中起關鍵作用，關于LCYB和LCYE啟動子的研究較少，目前僅在番茄（Solanum habrochaites）［21］、杧 果（Mangifera indica）［22］、西瓜（Citrullus lanatus）［23］等作物上有報道。李靜［24］在研究黃瓜和西瓜基因組中類胡蘿卜素合成相關基因的比較分析中將3種葫蘆科植物的LCYB和LCYE啟動子序列進行比較，發(fā)現(xiàn)LCYB的啟動子序列是高度保守的，而LCYE啟動子序列不同物種間會有一段序列的插入或缺失，但這并不是造成番茄紅素積累差異的原因。柑橘CsLCYb1啟動子長度為1 584 bp，含有大量激素響應元件如赤霉素響應元件GARE-motif、水楊酸響應元件the TCA motif和生長素響應元件TGA motif等，并通過相應的激素誘導說明其能提高CsLCYb1啟動子活性［25］。外源GA3處理抑制番茄成熟過程中各部位類胡蘿卜素和番茄紅素含量，對β-胡蘿卜素含量的影響表現(xiàn)為先抑制后促進的作用；外源ABA處理増加了番茄果實中類胡蘿素和β-胡蘿卜素的含量［26］。OfLCYB和OfLCYE啟動子都具有多個激素響應元件。OfLCYB啟動子中包含一個脫落酸響應元件ABRE，水楊酸響應元件TCA-element和一個赤霉素響應元件P-box；OfLCYE啟動子中包含一個赤霉素響應元件GARE-motif和3個水楊酸響應元件TCA-element，推測這兩個啟動子的轉錄水平應該受到ABA、赤霉素和水楊酸等激素的影響。有研究表明植物基因5'UTR區(qū)對基因的表達調控起著重要作用［27］，水稻中的5' UTR的內含子可使rubi3的轉錄水平大幅度提升［28］。在OfLCYB啟動子-585 bp處有一個5' UTR區(qū)，可能對該基因的表達起重要的調控作用。在OfLCYB啟動子-896 bp處發(fā)現(xiàn)一個MYB的結合位點MBS，推測MYB也可能對LCYB的表達起調控作用。OfLCYE啟動子-520 bp處含有一個熱激響應元件HSE，表明該基因表達可能受溫度調控。除此之外，OfLCYB和OfLCYE啟動子含有多個不同類型的光響應元件，如ACE、Box 4、GATT-motif、Sp1、AE-box和G-box，推測OfLCYB和OfLCYE啟動子的表達可能受光信號的調控。在不同的光周期和不同的光質條件下，越桔（Vaccinium myrtillus L.）果實中包括LCYB和LCYE在內的類胡蘿卜素代謝途徑中的相關基因表達水平不同，說明光照對LCYB和LCYE的表達可能有一定的影響［29］。

圖3 OfLCYE啟動子中相關順式作用元件預測分析

圖4 OfLCYB和OfLCYE啟動子瞬時表達檢測

瞬時表達結果表明OfLCYB和OfLCYE啟動子可以驅動GUS基因在煙草葉片中的表達，但OfLCYB啟動子驅動基因表達較少，這可能是由于OfLCYB啟動子活性較低或具有組織表達特異性所致。前期研究發(fā)現(xiàn)在不同溫度處理下‘堰虹桂’OfLCYB和OfLCYE的表達量隨溫度變化有明顯變化，尤其是OfLCYB基因。本研究對OfLCYB和OfLCYE啟動子中的元件預測發(fā)現(xiàn)僅OfLCYE啟動子中含與溫度相關的元件HSE，而OfLCYB啟動子中大多數為激素相關元件。在用25 mg/L和50 mg/L的水楊酸對紅潮球菌（Haematococcus pluvialis）進行處理發(fā)現(xiàn)包括LCY基因在內的部分類胡蘿卜素代謝相關基因的轉錄水平得到明顯提高［30］。因此推測在桂花中這些激素先與溫度相互作用，而后進一步共同調控基因的表達。相關結果有待進一步實驗加以驗證。

4 結論

本實驗克隆了桂花番茄紅素環(huán)化酶基因OfLCYB和OfLCYE啟動子，并通過瞬時表達分析證明了這兩個啟動子具有活性。這兩個啟動子都含有一些水楊酸、赤霉素等激素響應元件，推測對這兩個基因的表達起了一定作用。

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