合成生物學(xué)在改善腸道健康狀態(tài)中的應(yīng)用與展望

杜若曦 郭明璋 謝子鑫 賀曉云 黃昆侖 許文濤

（1. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京 100194；2. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083）

隨著現(xiàn)代社會(huì)生活方式、飲食習(xí)慣等的改變，人類腸道疾病的發(fā)病率呈增長趨勢，如何治療腸道疾病，維持腸道健康已成為研究者關(guān)注的重點(diǎn)。由于腸道疾病的發(fā)病機(jī)理復(fù)雜，治療手段局限，多為藥物及手術(shù)治療，效果欠佳，大部分腸道疾病目前無法完全治愈。令人欣喜的是，近年來的研究表明，腸道中的微生物對腸道的免疫調(diào)節(jié)、營養(yǎng)物質(zhì)代謝等有至關(guān)重要的作用，研究者以此為基礎(chǔ)，開發(fā)出利用微生物制劑調(diào)節(jié)腸道菌群，改善腸道狀況的方法，如利用天然益生菌對腸道菌群進(jìn)行調(diào)節(jié)［1-2］，或者利用菌群移植的方法將健康的人的菌群移植到病人體內(nèi)［3-4］，這些方法對部分病人的腸道疾病具有一定的改善作用，但由于機(jī)理上不明確，方法上不可控，這些方法的廣譜有效性受到質(zhì)疑。因此這些方法往往只用于輔助治療，并不能作為治療特定腸道疾病的針對性方法。

與傳統(tǒng)的益生菌干預(yù)和腸道菌群移植相比，合成生物學(xué)用于調(diào)控腸道菌群具有更多維的調(diào)控靶標(biāo)和更好的調(diào)控針對性。將合成生物學(xué)與腸道疾病的治療結(jié)合起來，可以有效的改善機(jī)體健康狀況。以潰瘍性結(jié)腸炎（Ulcerative colitis，UC）為例，該病是由人體遺傳基因變異、腸道菌群失調(diào)、飲食結(jié)構(gòu)改變等多種病因所引起的腸道慢性及復(fù)發(fā)性炎癥［16-17］。其中腸道菌群失衡和飲食結(jié)構(gòu)改變導(dǎo)致腸道內(nèi)抗原成分的變化，宿主遺傳基因變異導(dǎo)致腸壁細(xì)胞對腸道內(nèi)抗原成分識別狀態(tài)的變化，二者共同作用導(dǎo)致宿主機(jī)體長期處于炎性狀態(tài)，從而導(dǎo)致疾病發(fā)生。通過合成生物學(xué)設(shè)計(jì)改造工程菌株，使其能感知飲食成分、腸道菌群組成及腸壁細(xì)胞狀態(tài)的變化，隨之啟動(dòng)自身藥物的表達(dá)，從而幫助腸道營養(yǎng)素代謝、腸道菌群改善、修復(fù)受損細(xì)胞，就可以有效的治療潰瘍性結(jié)腸炎，控制其惡化。

近年來，合成生物學(xué)方法與腸道疾病治療方面出現(xiàn)了許多交集，但該方向的各研究之間相對比較獨(dú)立松散，并未形成一套完整的技術(shù)理論體系。本文對合成生物學(xué)在腸道菌群調(diào)節(jié)、腸道代謝改善、腸壁細(xì)胞狀態(tài)調(diào)控3個(gè)方面的實(shí)踐進(jìn)行了總結(jié)，在此基礎(chǔ)上對未來合成生物學(xué)方法用于腸道疾病治療的技術(shù)體系進(jìn)行展望。

1 合成生物學(xué)在調(diào)節(jié)腸道菌群中的應(yīng)用

正常腸道菌群對腸道健康的維持有著至關(guān)重要的作用。腸道菌群失衡或食源性病原菌的侵入，會(huì)引發(fā)宿主疾病，損害機(jī)體?，F(xiàn)階段，針對腸道菌群失衡，醫(yī)學(xué)上主要采用益生菌干預(yù)或者腸道菌群移植的方法進(jìn)行改善，因這些方法都是非靶向性的，故治療效果不佳，且可能會(huì)有副作用。針對病原菌侵入，醫(yī)學(xué)上大多采用口服抗生素進(jìn)行治療，大量研究結(jié)果表明，長期、高劑量的抗生素會(huì)使病原菌產(chǎn)生耐藥性，并且破壞正常的腸道菌群結(jié)構(gòu)，出現(xiàn)內(nèi)源性感染、二重感染及免疫力下降等問題［18］。因此，如何開發(fā)新型的腸道菌群調(diào)控的技術(shù)是當(dāng)前腸道菌群領(lǐng)域研究亟需解決的問題。

合成生物學(xué)可以實(shí)現(xiàn)腸道微生物靶向調(diào)控，抗菌物質(zhì)的誘導(dǎo)性分泌，抗菌物質(zhì)劑量降低等。在合成生物學(xué)中，靶向調(diào)控通過對致病菌群體感應(yīng)分子的檢測后，啟動(dòng)運(yùn)動(dòng)蛋白以及黏附素的表達(dá)，使其能夠趨向于病原體生長并黏附在靶細(xì)胞上。誘導(dǎo)性分泌同樣是在檢測到致病菌存在的信號后，激活相應(yīng)的啟動(dòng)子表達(dá)藥物分子。由于其具有靶向性和誘導(dǎo)性，從而降低抗菌物質(zhì)的用量。并且藥物在微生物體內(nèi)合成，可以使用分子量小、光譜抗菌、熱穩(wěn)定性好、抗菌機(jī)理獨(dú)特的抗菌肽替代人工體外合成的抗生素［19］，進(jìn)一步降低了致病菌的耐藥性。

1.1 直接殺死致病菌

合成微生物可以通過分泌抗菌物質(zhì)殺死腸道內(nèi)的特定致病菌。Saeidi等［20］將抗菌物質(zhì)的基因序列插入到可以被銅綠假單胞菌分泌物激活的啟動(dòng)子下游。工程大腸桿菌luxR啟動(dòng)子可以被銅綠假單胞菌分泌的LasR復(fù)合物激活，開啟其下游的E7裂解蛋白和S5膿菌素在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，當(dāng)E7蛋白的濃度達(dá)到閾值時(shí)會(huì)引起大腸桿菌裂解，這樣積累的膿菌素S5就會(huì)釋放，殺死銅綠假單胞菌。Gupta等［21］利用大腸桿菌建立的裝置同樣是通過結(jié)合P.aeruginosa（PAO1）的QS分子3OC12HSL來開啟。研究優(yōu)化了抗菌物質(zhì)，使用殺傷效果更好的FlgMCoPy。同時(shí)，增加了一個(gè)表達(dá)GFP的報(bào)告系統(tǒng)，使大腸桿菌同時(shí)具有診斷和治療兩個(gè)功能。

Hwang等［22］改造的大腸桿菌進(jìn)一步完善，可以經(jīng)過識別、遷移、釋放抗菌物質(zhì)等一系列步驟靶向殺死游離或者產(chǎn)生生物膜的銅綠假單胞菌。在大腸桿菌中建立了群體感知（Quorum sensing，QS）裝置（感知模塊），可以識別游離的和生物膜包裹的銅綠假單胞菌細(xì)胞分泌的QS分子?；呓z氨酸內(nèi)酯（N-Acyl homoserine lactone，AHL），在感知到銅綠假單胞菌的存在下，細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和殺傷模塊被激活。AHL反應(yīng)的趨化性使得大腸桿菌在自身表達(dá)的CheZ下沿AHL的濃度梯度生長，從而細(xì)胞將更接近銅綠假單胞菌（運(yùn)動(dòng)模塊）。此外，AHL激活了密碼子優(yōu)化后的抗菌肽（MccS）和抗菌膜酶（DNaseI）的表達(dá)和分泌，在靶向針對病原體的情況下，通過殺死病原體和破壞生物膜的雙重作用消滅致病菌（殺傷模塊）。

為了消除腸道內(nèi)革蘭氏陰性致病菌，研究者將兩種針對革蘭氏陰性菌的抗菌肽A3APO和Alyteserin經(jīng)過密碼子優(yōu)化后，與信號肽Usp45融合，插入到乳鏈球菌素誘導(dǎo)啟動(dòng)子PsinA的下游，將該序列轉(zhuǎn)入到乳酸乳球菌IL1403中。該微生物表達(dá)相應(yīng)的抗菌肽，能殺滅革蘭氏陰性菌大腸桿菌、沙門氏菌，并對乳酸菌幾乎無殺傷作用［23］。

同樣機(jī)理也適用于殺傷霍亂弧菌。在野生型大腸桿菌中建立一個(gè)感應(yīng)和殺死系統(tǒng)，使其能夠通過QS分子CAI-1檢測霍亂弧菌，并激活表達(dá)裂解蛋白YebF-Art-085，機(jī)體裂解后使體內(nèi)的Art-085釋放，殺死霍亂弧菌［24］。

與表達(dá)抗菌物質(zhì)不同，噬菌體的受控遞送系統(tǒng)是另一種殺傷病原體的方式。將編碼T4 lysozyme、T4 holin、T4 antiholin的序列置于pLacO啟動(dòng)子的控制之下，轉(zhuǎn)入到E. coli K-12中，使其可以誘導(dǎo)表達(dá)噬菌體。工程細(xì)菌（EB）通過表達(dá)噬菌體實(shí)現(xiàn)兩個(gè)功能：調(diào)節(jié)自身的數(shù)量增長和裂解釋放噬菌體來消滅霍亂弧菌［25］。

1.2 阻止病原體的黏附

Bacillus cereus CH是一種益生菌菌株，其表面的鞭毛蛋白可以與黏蛋白（Mucin）結(jié)合。將鞭毛蛋白基因插入乳鏈菌肽誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的下游，轉(zhuǎn)入乳酸乳球菌中。改造的菌株在用乳鏈菌肽誘導(dǎo)6h后產(chǎn)生表面相關(guān)的鞭毛蛋白。重組乳球菌菌株強(qiáng)烈黏附在涂覆黏蛋白的聚苯乙烯板上，同時(shí)可以抑制病原體E. coli LMG2092和腸炎沙門氏菌的黏附［26］。

在胃腸道中，李斯特黏附蛋白（LAP）幫助L.monocytogenes由細(xì)胞旁路穿過上皮屏障。使用表達(dá)LAP的重組益生菌將有助于從腸道中有針對性地清除李斯特菌，并保護(hù)高危人群免受感染［27］。

1.3 抑制毒素毒性

除了直接殺死病原體外，微生物還能通過降低致病菌毒素的毒力來維持腸道健康。將腦膜炎奈瑟菌或空腸彎曲桿菌的糖基轉(zhuǎn)移酶基因轉(zhuǎn)入無致病性的大腸桿菌，作用于致病性大腸桿菌分泌的腸毒素，治療和預(yù)防腸毒素引起的腹瀉癥狀［28］。同樣，將來自淋病奈瑟氏球菌和空腸彎曲桿菌的糖基轉(zhuǎn)移酶基因轉(zhuǎn)入到無害的大腸桿菌中，使其模擬神經(jīng)節(jié)苷脂GM（1）的方式生產(chǎn)嵌合的脂多糖。重組大腸桿菌表達(dá)的脂多糖能以高親合力結(jié)合霍亂毒素，能在體外吸附其自身重量5%的毒素。在小鼠感染之后進(jìn)行，也能保護(hù)幼鼠免受毒性霍亂弧菌的攻擊［29］。

研究發(fā)現(xiàn)，CAI-1也可以降低霍亂毒素的毒性。CAI-1是一種自體誘導(dǎo)分子，當(dāng)它與另一種分子CAI-2在高濃度下共存時(shí)，可以防止霍亂毒素的毒力作用。將編碼最終CAI-1合成酶的基因cqsA插入到天然組成型啟動(dòng)子fliC的下游，轉(zhuǎn)入大腸桿菌中表達(dá)。用表達(dá)CAI-1（Nissle-cqsA）的大腸桿菌預(yù)處理小鼠，增加了小鼠攝入霍亂弧菌后的存活率（92%）［30］。

1.4 調(diào)控腸道菌群組成

許多微生物通過表達(dá)群體感應(yīng)分子進(jìn)行細(xì)胞間交流，通過這種相互作用可以人為調(diào)節(jié)菌群密度。費(fèi)希爾氏弧菌是典型的群體感應(yīng)細(xì)菌，lux box、luxR和luxI是已知的群體感應(yīng)關(guān)鍵元件［31］。為了維持一個(gè)相對穩(wěn)定的細(xì)胞密度，利用LuxI/LuxR與自由擴(kuò)散的信號分子AHL共同構(gòu)成一個(gè)裝置。當(dāng)細(xì)胞數(shù)量增加時(shí)，AHL在細(xì)胞和培養(yǎng)基中逐漸積累。當(dāng)AHL的濃度達(dá)到一個(gè)較高的數(shù)值后，會(huì)與LuxR的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合活化，并激活在luxI啟動(dòng)子（pluxI）之下killer gene（E）的表達(dá)。足夠高的殺傷蛋白水平會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡，以此來維持一個(gè)較為穩(wěn)定的微生物密度［32］。

同樣利用來自費(fèi)希爾氏弧菌的lux box、luxR和luxI將幾種程序性cell-death BioBricks和quorums sensing基因置于lux pR和PlacO-1啟動(dòng)子的控制下，轉(zhuǎn)入大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)。研究表明，改造后細(xì)菌成功地相互感知并相互通信，以巧妙地控制其群體密度［33］。以群體感應(yīng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)電路為基礎(chǔ)，不同的抗生素水平和初始細(xì)胞密度會(huì)引起相關(guān)的菌群關(guān)系變化，如滅絕、強(qiáng)制性共生、兼性共生和共生［34］。

微生物間的菌群調(diào)節(jié)往往不是單向的，也存在雙方共同決定的情況。“捕食者-獵物系統(tǒng)”就是這樣一個(gè)有趣的菌群調(diào)節(jié)系統(tǒng)。它由兩個(gè)大腸桿菌菌群組成，通過群體感知的雙向通信、工程基因回路來調(diào)節(jié)彼此的基因表達(dá)和存活。捕食者通過誘導(dǎo)獵物中殺傷蛋白的表達(dá)來殺死獵物，而獵物通過引發(fā)捕食者中解毒劑蛋白的表達(dá)來自我拯救［35］。假若將這種機(jī)制引入到腸道中，就可以使腸道菌群處于動(dòng)態(tài)平衡之中。

利用合成生物學(xué)改造的微生物可以通過抑制病原體黏附于腸壁來防止其入侵，也可以直接殺死病原體或減弱其毒素毒性降低致病性，也能夠通過細(xì)胞間交流調(diào)節(jié)腸道菌群，從而維持腸道健康（圖1）。微生物作為藥用載體的方法，不用擔(dān)心藥物口服之后在胃酸環(huán)境下會(huì)被分解代謝，有效的降低抗菌物質(zhì)的使用量而達(dá)到相同的治療效果，并且省去了體外合成和純化的步驟。同時(shí)，一種微生物可以表達(dá)多種抗菌物質(zhì)，提高了治療的效率［36］。但是研究發(fā)現(xiàn)，抗菌肽對哺乳動(dòng)物細(xì)胞也有一定的細(xì)胞毒性。所以在之后的研究中，選擇合適的抗菌物質(zhì)，及時(shí)停止微生物表達(dá)抗菌肽，并消除在體內(nèi)的殘留，副作用更低，使治療更加安全是研究的重點(diǎn)。

2 合成生物學(xué)調(diào)節(jié)營養(yǎng)物質(zhì)代謝

在醫(yī)療上，代謝紊亂是一種狀態(tài)，即身體的供需平衡被打破，引起相應(yīng)的疾病，如脂肪代謝紊亂引起肥胖癥，糖代謝紊亂引起糖尿病，這些病癥的進(jìn)一步惡化會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的心血管疾病。現(xiàn)今，肥胖癥多通過控制飲食加強(qiáng)運(yùn)動(dòng)、藥物和手術(shù)治療。但是改變生活習(xí)慣需要患者強(qiáng)大的意志力，見效緩慢；藥物治療的副作用大且醫(yī)學(xué)上對于使用何種藥物沒有明確的闡述，用藥應(yīng)十分謹(jǐn)慎；手術(shù)治療會(huì)引起并發(fā)癥。對于糖尿病的治療主要是控制飲食、注射胰島素、服用藥物等。這種治療手段無法根治糖尿病且影響患者正常生活，藥物的長期使用會(huì)對其他器官產(chǎn)生損傷。這些不完善的治療手段驅(qū)使著科學(xué)家為了人類的健康繼續(xù)探索。

圖1 合成生物學(xué)調(diào)節(jié)腸道菌群研究時(shí)間軸

研究發(fā)現(xiàn)，雖然在腸道中沒有發(fā)現(xiàn)這些疾病的直接癥狀，但與腸道的代謝息息相關(guān)。攝入食物后，小腸主要進(jìn)行大分子營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收；小腸內(nèi)未被消化的蛋白質(zhì)、碳水化合物等進(jìn)入大腸，被大腸內(nèi)微生物發(fā)酵從而進(jìn)一步利用［37］。微生物既可以幫助腸道內(nèi)的脂質(zhì)代謝［38］，也可以促進(jìn)后腸中鈣、磷等礦物質(zhì)的吸收，部分微生物還可以合成多種維生素［39］。腸道進(jìn)行消化吸收時(shí)需要腸道微生物的參與，合成生物學(xué)以此為切入點(diǎn)，構(gòu)建了治療代謝紊亂的新模型。改造后的微生物可以直接控制營養(yǎng)物質(zhì)的合成分解，也可以通過調(diào)控體內(nèi)激素的表達(dá)來平衡機(jī)體內(nèi)的代謝過程。在合成生物學(xué)中，使工程微生物表達(dá)代謝途徑中的中間產(chǎn)物或終產(chǎn)物來改變其代謝路線；而機(jī)體內(nèi)的反饋?zhàn)饔檬沟梦⑸镎{(diào)節(jié)激素水平成為可能，通過表達(dá)一種激素來促進(jìn)或抑制其他激素的產(chǎn)生，從而利用激素調(diào)節(jié)代謝。這種方法不會(huì)限制患者的飲食，不必考慮手術(shù)的并發(fā)癥，也沒有藥物副作用的產(chǎn)生，而且微生物會(huì)在腸道中定居繁殖，使得治療可以持久有效。

2.1 直接代謝

N-酰基磷脂酰乙醇胺（NAPE）是N-?；掖减０罚∟AE）脂質(zhì)家族的前體，其在小腸中合成以減少食物攝取和肥胖。將擬南芥中催化NAPE合成的At1g78690（一種N-?；D(zhuǎn)移酶）轉(zhuǎn)入E. coli C41-DE3菌株。這些細(xì)菌中的NAPE水平顯著增加。實(shí)驗(yàn)證明，在飲用水中加入工程化的表達(dá)NAPE的E.coli Nissle1917細(xì)菌8周后，降低了飼喂高脂肪飲食的小鼠的肥胖水平。與接受標(biāo)準(zhǔn)水或?qū)φ占?xì)菌的小鼠相比，接受改良細(xì)菌的小鼠顯著降低了食物攝取量、肥胖、胰島素抵抗和肝硬化的發(fā)生幾率。此外，向TallyHo小鼠（肥胖的多基因小鼠模型）施用表達(dá)NAPE的細(xì)菌，可以抑制體重的增加［40］。

將兩個(gè)基因序列插入到大腸桿菌中。果糖脫氫酶（fdh）基因，用于將果糖轉(zhuǎn)化為5-酮-D-果糖（Fructose to 5-keto-D-fructose），甘露醇-2-脫氫酶（Mannitol-2-dehydrogenase，mtlK）基因?qū)⒐寝D(zhuǎn)化為甘露醇。高果糖喂養(yǎng)的大鼠體重、血清葡萄糖、肝損傷標(biāo)志物、血清和肝臟脂質(zhì)譜均顯著增加，抗氧化酶活性降低。然而，用EcN（pqq-glf-mtlK）和EcN（pqq-fdh）處理的大鼠，隨著血清和肝臟抗氧化酶活性的增加，表現(xiàn)出脂質(zhì)過氧化作用明顯降低，同時(shí)觀察到肝損傷標(biāo)記酶的恢復(fù)。改造的E. coli Nissle 1917可以減少飲食果糖慢性消耗引起的代謝影響［41］。

2.2 調(diào)控宿主代謝

無活性全長形式的GLP-1（1-37）可以刺激大鼠和人腸上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化成胰島素分泌細(xì)胞。使用SlpA啟動(dòng)子和USP45-LEISS分泌信號肽，下游插入GLP-1（1-37）序列，轉(zhuǎn)入到乳酸桿菌，使其表達(dá)分泌GLP-1（1-37）?？诜置贕LP-1（1-37）的共生細(xì)菌可以改善大鼠糖尿病模型中的高血糖。每天給予糖尿病大鼠分泌GLP-1（1-37）的乳酸桿菌，觀察到大鼠胰島素水平顯著增加，并且葡萄糖耐受性更高。這些大鼠在上腸內(nèi)發(fā)育出足以代替非糖尿病健康大鼠的胰島素生成細(xì)胞。具有重編程細(xì)胞的大鼠中的腸組織表達(dá)MafA、PDX-1和FoxA2。這些結(jié)果證明了安全有效的非吸收性糖尿病口服治療的潛力，并支持了設(shè)計(jì)的共生細(xì)菌信號傳導(dǎo)在體內(nèi)介導(dǎo)腸細(xì)胞功能的概念［42］。

合成生物學(xué)通過口服工程微生物的方式，對代謝進(jìn)行直接或間接調(diào)控。這一方法避免了用藥的依賴性和手術(shù)的副作用，是未來醫(yī)學(xué)的主要發(fā)展方向。但是因?yàn)樯眢w是一個(gè)復(fù)雜而且平衡的環(huán)境，人為改變其激素水平和代謝途徑是否會(huì)產(chǎn)生其他損傷或者腺體功能是否因此而降低還無法給出確切的答案。對于身體機(jī)理的不明確性，是合成微生物應(yīng)用的限制，也是將來主要的研究問題。

3 合成生物學(xué)與腸道細(xì)胞狀態(tài)的診斷及調(diào)節(jié)

現(xiàn)階段對腸道病癥的診斷多通過腸鏡、X線鋇餐、放射性核素、選擇性血管造影、CT等，這些手段價(jià)格高昂，存在安全性問題。近幾年來進(jìn)入人們視野的超聲檢測，雖然無創(chuàng)傷、無輻射，但其顯像效果欠佳，檢測前準(zhǔn)備工作多、時(shí)間長，對操作者的技術(shù)要求高［43］。對于疾病及腫瘤的診斷治療，也因?yàn)榘邢蛐缘娜狈?，用藥或者化療等手段在殺死病變?xì)胞的同時(shí)，也對健康細(xì)胞產(chǎn)生了副作用，這種“兩敗俱傷”的治療方法急需合適的替代。

細(xì)胞狀態(tài)是腸道健康與否的直接反映。在細(xì)胞發(fā)生病變時(shí)，其表達(dá)水平也隨之產(chǎn)生變化。利用合成微生物，可以對腸道細(xì)胞狀態(tài)進(jìn)行快速準(zhǔn)確的檢測。將能被疾病特有信號激活的啟動(dòng)子置于報(bào)告分子的上端，就可以在疾病發(fā)生的情況下，表達(dá)相應(yīng)的輸出信號，進(jìn)行快速的診斷治療。合成微生物感知的信號，不局限于蛋白質(zhì)、糖類或其他活性物質(zhì)，也可對部分環(huán)境變化（缺氧）做出反應(yīng)。將診斷與治療起來，有效的解決了現(xiàn)階段醫(yī)療中靶向性不足的問題，對患者健康組織起到了很好的保護(hù)作用，是更為完善的一種醫(yī)療方法。

3.1 疾病診斷的生物傳感器

因?yàn)橐谎趸缴呤悄c道炎癥發(fā)生的重要標(biāo)志，所以選擇能夠識別NO信號的大腸桿菌，利用其自身的DNA重組酶FimE和催化重組的序列fims共同構(gòu)成一個(gè)報(bào)告裝置?；蚋脑旌蟮拇竽c桿菌，在NO缺乏的情況下，NorR蛋白阻礙NO還原酶NorV的啟動(dòng)子（PnorV）的轉(zhuǎn)錄，從而沒有重組酶的表達(dá)，fimS向右轉(zhuǎn)錄表達(dá)黃色熒光蛋白（Yellow fluorescent protein，YFP）；當(dāng)NO充足時(shí)，NorR與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，開啟PnorV的轉(zhuǎn)錄，表達(dá)重組酶FimE，使得fimS序列重組，向左側(cè)轉(zhuǎn)錄表達(dá)青色熒光蛋白（Cyan fluorescent protein，CFP）。經(jīng)過試驗(yàn)驗(yàn)證，該報(bào)告系統(tǒng)對化學(xué)和生物來源一氧化氮都有很好的靈敏度［44］。這一報(bào)告裝置不僅可以完成檢測任務(wù)，對于后期加入藥物表達(dá)，完成由診斷到治療的一系列任務(wù)，是意義重大的進(jìn)展。

類似的工程細(xì)菌診斷疾病的應(yīng)用還有一些。鼠傷寒沙門氏菌和耶爾森氏菌誘導(dǎo)的小腸結(jié)腸炎癥中，硫代硫酸鹽會(huì)在小鼠腸中轉(zhuǎn)化為四硫酸［45］。將海洋細(xì)菌中的識別硫代硫酸鹽和四硫酸的序列轉(zhuǎn)入到大腸桿菌中，用于診斷結(jié)腸炎癥［46］。設(shè)計(jì)的共生鼠大腸桿菌檢測在炎癥期間產(chǎn)生的四硫酸，通過糞便測試診斷［47］。

Kotula等［48］構(gòu)建的一個(gè)兩部分系統(tǒng)，“觸發(fā)元件”lambda Cro基因由四環(huán)素誘導(dǎo)啟動(dòng)子控制轉(zhuǎn)錄，“記憶元件”是源自λ噬菌體的cI/Cro區(qū)域。用脫水四環(huán)素處理含有改造大腸桿菌的小鼠時(shí)，所回收的細(xì)菌都均為Cro狀態(tài)，而未處理小鼠的細(xì)胞仍處于cI狀態(tài)。這個(gè)機(jī)制通過更換相應(yīng)的啟動(dòng)子，能夠診斷更多的腸道疾病。

3.2 調(diào)節(jié)腸道免疫系統(tǒng)

合成生物學(xué)在增強(qiáng)腸道免疫作用上也有所嘗試。Robert等［49］為了解決口服蛋白質(zhì)藥物會(huì)被降解的問題，建立了乳酸乳球菌耐受性細(xì)菌傳播技術(shù)。用于控制分泌type 1型糖尿病自身抗原（GAD）-65和腸道內(nèi)抗炎癥細(xì)胞因子IL-10。研究證明，與短期低劑量anti-CD3聯(lián)合使用，即使在診斷時(shí)高血糖嚴(yán)重的情況下，這種治療仍可以穩(wěn)定胰島炎，維持功能性β細(xì)胞的數(shù)量，使近期發(fā)作的NOD小鼠血糖恢復(fù)正常。聯(lián)合治療不能消除致病效應(yīng)T細(xì)胞，但增加了功能性CD4+Foxp3+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的數(shù)量。

del Carmen等［50］建立了2種新型表達(dá)系統(tǒng)，重組乳球菌通過遞送IL-10在模擬IBD復(fù)發(fā)的鼠結(jié)腸炎模型中具有保護(hù)作用。第一個(gè)系統(tǒng)基于粘膜表面產(chǎn)生和遞送異源蛋白質(zhì)的應(yīng)激誘導(dǎo)控制表達(dá)系統(tǒng)，第二個(gè)系統(tǒng)將il-10 cDNA盒包含在真核DNA表達(dá)載體（pValac）中遞送至宿主細(xì)胞。提供IL-10蛋白或cDNA的乳球菌菌株降低TNBS誘導(dǎo)的慢性結(jié)腸炎的嚴(yán)重程度。研究結(jié)果證實(shí)IL-10作為蛋白質(zhì)或作為cDNA在模擬IBD復(fù)發(fā)性質(zhì)的結(jié)腸炎模型中的具有保護(hù)作用。

3.3 腫瘤細(xì)胞的定位

將來自耶爾森氏桿菌假性肺炎的侵入物作為輸出模塊，使得改造后的大腸桿菌能夠侵入癌細(xì)胞。為了環(huán)境限制入侵，以費(fèi)希爾氏弧菌lux群體感應(yīng)回路為背景，將該模塊置于缺氧反應(yīng)性fdhF啟動(dòng)子或阿拉伯糖誘導(dǎo)型araBAD啟動(dòng)子的控制下。這種細(xì)菌可以感測腫瘤的微環(huán)境，并通過侵入癌細(xì)胞和釋放細(xì)胞毒性劑來發(fā)揮殺傷作用［51］。

去毒后的鼠傷寒沙門氏菌（S. typhimurium）菌株可以選擇性地生長和表達(dá)腫瘤中的外源基因用于靶向治療。Chen等［52］的設(shè)計(jì)鼠傷寒沙門氏菌菌株VNP20009，可以在缺氧誘導(dǎo)的nirB啟動(dòng)子的控制下分泌腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體（TRAIL）。改造后的VNP優(yōu)先在腫瘤組織中累積，并且nirB啟動(dòng)子有效驅(qū)動(dòng)TRAIL的靶向表達(dá)。研究證明，表達(dá)TRAIL的VNP20009通過誘導(dǎo)黑素瘤細(xì)胞凋亡，產(chǎn)生其抗腫瘤作用。使用表達(dá)TRAIL的沙門氏菌介導(dǎo)的腫瘤靶向治療可以減少腫瘤生長并延長宿主的存活時(shí)間。

黏附素的使用也有效的解決了腫瘤定位和治療靶向性的問題。細(xì)菌自身表達(dá)的黏附素（adhesins），對其生物膜形成、宿主定植和細(xì)胞侵襲有著重要的作用。利用已知的黏附素序列，保留其本身的信號肽和β結(jié)構(gòu)域，只將其Ig結(jié)構(gòu)域替換為heavy-chainonly antibody（VHH），利用自殺質(zhì)粒將該序列轉(zhuǎn)入大腸桿菌基因組中，構(gòu)造出一個(gè)產(chǎn)生合成黏附素的大腸桿菌。實(shí)驗(yàn)證明，該大腸桿菌在隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的過程中，緊密黏附于表達(dá)相應(yīng)抗原的腫瘤細(xì)胞上，并且，該工程大腸桿菌在肝臟和脾臟的殘留量低。這一研究有效的解決了腫瘤定位的問題，將其與藥物結(jié)合起來，是一種有效的治療方法［53］。

利用RNA也可以確定腫瘤細(xì)胞。構(gòu)建由siRNA靶向轉(zhuǎn)錄Lac阻遏物（LacI）和LacI-controlled啟動(dòng)子CAGop（CAG啟動(dòng)子，隨后是具有兩個(gè)LacO位點(diǎn)的內(nèi)含子）組成的細(xì)胞分型器。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)瞬時(shí)表達(dá)時(shí)，分類器確定六種內(nèi)源性miRNA的表達(dá)譜是否符合HeLa宮頸癌細(xì)胞系特征的預(yù)定參考譜。將匹配細(xì)胞識別為HeLa并觸發(fā)細(xì)胞凋亡［54］。這些腫瘤檢測技術(shù)在腸道內(nèi)的嘗試與應(yīng)用，將開啟癌癥診斷的新篇章。

通過微生物與細(xì)胞間的交流，合成生物學(xué)對腸道疾病進(jìn)行監(jiān)測和定位。人為改造的細(xì)菌能夠感知環(huán)境，區(qū)分細(xì)胞類型，遞送蛋白質(zhì)，建立由環(huán)境信號決定的細(xì)菌和癌細(xì)胞之間的相互作用，使其完成相應(yīng)的定位任務(wù)。微生物對細(xì)胞的膜上和胞外分子，特異性結(jié)合并激活相應(yīng)的啟動(dòng)子開啟轉(zhuǎn)錄，完成相應(yīng)的任務(wù)。后續(xù)研究需要擴(kuò)大微生物感知信號的類型，并尋找相應(yīng)的啟動(dòng)子；將細(xì)胞狀態(tài)的檢測和定位，與藥物治療相結(jié)合是進(jìn)一步的研究重點(diǎn)。

4 總結(jié)與展望

4.1 合成生物學(xué)在改善腸道健康狀態(tài)中存在的問題

合成生物學(xué)應(yīng)用于維護(hù)腸道健康有著巨大的優(yōu)勢和可塑性，前景十分廣闊。按照意愿改造微生物，使其完成指定的檢測、黏附、調(diào)節(jié)、分泌、裂解等任務(wù)，能夠在不對其他細(xì)胞、組織產(chǎn)生損傷的情況下，治療腸道疾病，維護(hù)腸道健康。盡管合成生物學(xué)優(yōu)點(diǎn)明顯，依然有很多問題有待解決。

首先，當(dāng)前合成生物學(xué)可以使用的功能基因模塊種類和數(shù)量有限，許多功能無法完成。合成生物學(xué)改造的微生物應(yīng)該越來越功能化、標(biāo)準(zhǔn)化。它不應(yīng)只單純的完成一項(xiàng)任務(wù)，而是可以從識別到給藥等一系列的“自動(dòng)化”過程。那就要求研究人員不斷豐富合成微生物的序列，建立功能模塊，多個(gè)模塊組合完成信號收集、診斷、表達(dá)、分泌、自身裂解等指令；模塊自由組合，針對特定的病人完成相應(yīng)的任務(wù)。

其次，宿主的微生物群落和宿主細(xì)胞相互作用的機(jī)制不夠清晰，而這些機(jī)制對于微生物組合治療的合理設(shè)計(jì)至關(guān)重要?，F(xiàn)階段的研究多在嚙齒動(dòng)物中進(jìn)行驗(yàn)證，但動(dòng)物與人腸道微生物群落的數(shù)量結(jié)構(gòu)和復(fù)雜程度仍有差異，所以合成微生物在人體中能否穩(wěn)定遺傳和發(fā)揮作用，需要進(jìn)一步試驗(yàn)確定［55］。

另外，現(xiàn)階段合成生物學(xué)改造的微生物種類選擇較少，多局限于大腸桿菌、乳桿菌［56］和乳酸乳球菌［57-58］等（表1）。研究人員在合成生物學(xué)的微生物種類上應(yīng)有更多嘗試，利用各自的特性進(jìn)行不同的改造。

同時(shí)，盡管腸道疾病治療靶向性的問題在合成生物學(xué)的參與下，有了很好的改善，但是治療藥物存在殺傷力不夠或殺傷健康細(xì)胞的問題。藥物是治療的關(guān)鍵，種類和用量都要嚴(yán)格的考量，防止其對健康的腸道細(xì)胞產(chǎn)生不可逆轉(zhuǎn)的傷害。

最后，合成微生物在離開體內(nèi)后對環(huán)境可能會(huì)造成影響，在研究過程中避免發(fā)生基因的遷移，充分消除其隱患，使合成生物學(xué)的應(yīng)用更加安全。

4.2 應(yīng)用合成生物學(xué)方法的建立新型益生菌體系

“個(gè)性化醫(yī)療”的理念受到越來越多的重視，然而在腸道健康調(diào)控的領(lǐng)域，應(yīng)用益生菌進(jìn)行腸道健康干預(yù)時(shí)，其“個(gè)性化”卻是相當(dāng)薄弱的。當(dāng)不同癥狀、不同疾病的患者，只能服用相同或者相似的幾種益生菌制劑時(shí)，其治療或者輔助治療的效果通常無法保證。應(yīng)用合成生物學(xué)，針對不同腸道疾病的發(fā)病機(jī)制，開發(fā)出針對性的益生菌，將開啟益生菌調(diào)控腸道健康的新紀(jì)元。為此，我們提出了以下技術(shù)上和管理上的建議。

表1 合成生物學(xué)在腸道中應(yīng)用的微生物種類

數(shù)據(jù)庫層面：合成生物學(xué)在腸道疾病診斷和治療的應(yīng)用，是調(diào)控轉(zhuǎn)錄、翻譯的結(jié)果。這一過程需要復(fù)雜的合成基因電路，建立合成生物學(xué)工具數(shù)據(jù)庫可以簡化這些步驟。數(shù)據(jù)庫根據(jù)控制RNA水平、控制蛋白質(zhì)翻譯和轉(zhuǎn)錄翻譯外的調(diào)控3個(gè)主要方向分類。調(diào)節(jié)RNA 轉(zhuǎn)錄的元件多為啟動(dòng)子，活化子、阻遏蛋白等［62］；調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)翻譯的主要為核糖體結(jié)合位點(diǎn)、taRNAs等；也可以通過修飾蛋白質(zhì)等進(jìn)行調(diào)控。除了生物信號識別元件，還包括各式各樣的信號輸出元件［63］。按照設(shè)計(jì)需求從數(shù)據(jù)庫中選擇相應(yīng)的電路元件，經(jīng)過簡單的拼接、切割構(gòu)成完整的基因通路，完成相應(yīng)的任務(wù)［64］。

分子生物學(xué)技術(shù)層面：選取適合的序列和元件后，要將其連接起來，并轉(zhuǎn)入到微生物體內(nèi)，這一切依托于分子生物學(xué)的方法。常用DNA酶對序列進(jìn)行合理剪切、連接，后用PCR擴(kuò)增，克隆的基因利用瓊脂糖凝膠電泳和DNA測序驗(yàn)證。將設(shè)計(jì)的DNA序列插入到載體質(zhì)粒中，通過制備感受態(tài)細(xì)胞等方法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)胞中或利用Crispr-Cas9技術(shù)將基因整合到細(xì)胞基因組中，使其能表達(dá)出新的性狀。

產(chǎn)品有效性評價(jià)層面：合成的基因序列需要以微生物為載體發(fā)揮作用。優(yōu)先在培養(yǎng)基中誘導(dǎo)其表達(dá)，確定合成電路的可行性；之后將工程細(xì)菌置于細(xì)胞中培養(yǎng)，驗(yàn)證其是否可以完成指定任務(wù)；經(jīng)過細(xì)胞試驗(yàn)的微生物為了確定能在動(dòng)物體內(nèi)穩(wěn)定發(fā)揮作用，需要進(jìn)一步的動(dòng)物試驗(yàn)；動(dòng)物試驗(yàn)表現(xiàn)出良好效果并不能完全適用于人體中，所以最終需要將微生物移植到人的腸道中確定其有效性。

產(chǎn)品安全性評價(jià)層面：驗(yàn)證工程微生物可以完成指定任務(wù)之后，要對其安全性進(jìn)行評價(jià)，這是該產(chǎn)品能否應(yīng)用于臨床治療的決定步驟。合成生物學(xué)所構(gòu)造的微生物可以通過新表達(dá)蛋白及菌株整體的致敏性評價(jià)、致畸性評價(jià)畸形毒性評價(jià)、亞慢性毒性評價(jià)等一系列安全評價(jià)試驗(yàn)評價(jià)其安全性。

產(chǎn)品認(rèn)證管理層面：《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理?xiàng)l例》第六條規(guī)定“國家對農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全實(shí)行分級管理評價(jià)制度”。合成生物學(xué)開發(fā)的新型菌株通過食用安全評價(jià)和環(huán)境安全評價(jià)后，會(huì)獲得安全證書，即證明該生物是安全的。消費(fèi)者對合成生物學(xué)開發(fā)的益生菌產(chǎn)品具有知情權(quán)和自主選擇的權(quán)利。在我國，新《食品安全法》第六十九條規(guī)定“生產(chǎn)經(jīng)營轉(zhuǎn)基因食品應(yīng)當(dāng)按照規(guī)定顯著標(biāo)示”。對于合成生物學(xué)開發(fā)的益生菌產(chǎn)品可以參考轉(zhuǎn)基因食品的標(biāo)示管理體系。

合成生物學(xué)通過改造微生物，在其體內(nèi)構(gòu)建基因回路，使微生物能夠完成診斷、靶向治療、運(yùn)輸、報(bào)告等任務(wù)，給腸道疾病的治療帶來了希望。合成生物學(xué)的出現(xiàn)同樣對食品加工、醫(yī)療診斷、環(huán)境檢測治理等領(lǐng)域起到了很好的推進(jìn)作用。盡管合成生物學(xué)有很多的優(yōu)點(diǎn)，但倫理道德和生物安全問題可能會(huì)成為限制其發(fā)展的重要因素。隨著科技的不斷進(jìn)步，降低風(fēng)險(xiǎn)、發(fā)揮優(yōu)勢才能給合成生物學(xué)的創(chuàng)造更大的發(fā)展空間。與此同時(shí)，自然界的一些成就對于人類來說很難再現(xiàn)。而在該領(lǐng)域的進(jìn)一步發(fā)展中成功的從業(yè)者將是那些明白如何理解自然生物學(xué)作品的，具有工程意識的人［65］。

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