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    內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫在植物中的研究進(jìn)展

    2018-01-31 03:45:19陳倩謝旗
    生物技術(shù)通報 2018年1期
    關(guān)鍵詞:內(nèi)質(zhì)網(wǎng)突變體底物

    陳倩 謝旗

    (1. 中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所 植物基因組學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100101;2. 中國科學(xué)院大學(xué),北京 100049)

    蛋白質(zhì)是參與生命體代謝、各種信號傳遞、生長發(fā)育的重要大分子,因此,其合成、正常的折疊修飾并根據(jù)信號肽到達(dá)發(fā)揮功能的相應(yīng)細(xì)胞器也是同樣重要的命題。分泌蛋白和膜蛋白在核糖體上開始合成后很快進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng),并在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)繼續(xù)合成新肽鏈以及對新肽鏈進(jìn)行初步的修飾。然而已有的研究顯示,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)濃度是100 g/L(大約是2 mmol/L),而一個α螺旋或β折疊正確折疊完成時間是0.1-1 μs,因此,在如此高蛋白濃度的場所進(jìn)行如此快速的折疊是非常復(fù)雜且易錯的[1-2]。為了保證只有正確折疊的蛋白質(zhì)進(jìn)入高爾基體,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中有一個專門負(fù)責(zé)監(jiān)測蛋白質(zhì)折疊水平的系統(tǒng),稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)質(zhì)量監(jiān)控系統(tǒng)(Endoplasmic reticulum quality control,ERQC)[3-4]。如果不能通過 ERQC 的監(jiān)測,蛋白質(zhì)會繼續(xù)留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中并在多種分子伴侶的幫助下進(jìn)行再折疊,直到達(dá)到正確構(gòu)象運(yùn)出內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或者被內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的降解系統(tǒng)(Endoplasmic reticulum associated degradation,ERAD)降解。積累在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的錯誤折疊蛋白超出了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)處理的范圍就會造成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫(ER stress),而一些外源或者內(nèi)源的脅迫壓力,如植物面臨的冷、熱、鹽和干旱等會加劇ER stress[5-8]。ER stress也會誘導(dǎo)非折疊蛋白反應(yīng)(Unfolded protein response,UPR),UPR進(jìn)一步誘導(dǎo)分子伴侶及脅迫相關(guān)基因的表達(dá),幫助細(xì)胞度過難關(guān)。

    ER stress、ERQC、UPR、ERAD等過程在酵母和動物方面研究較多,已經(jīng)有了被認(rèn)可的成熟機(jī)制。對植物的研究雖然起步較晚,但是近幾年發(fā)展迅速,多個相關(guān)基因及編碼蛋白的功能被一一揭示[9]。在本綜述中,我們將詳細(xì)總結(jié)蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的糖基化修飾過程、ERQC、UPR及ERAD識別錯誤折疊蛋白并發(fā)揮功能的過程,以及它們在植物生長發(fā)育過程中的作用。

    1 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)質(zhì)量監(jiān)控系統(tǒng)(ERQC)

    ERQC 的概念最早由 Hurtley和 Helenius[4]在1898年提出,主要涉及監(jiān)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)的折疊狀態(tài)。蛋白質(zhì)的折疊與初生肽鏈的N-鏈接蛋白質(zhì)糖基化修飾過程息息相關(guān)。加在蛋白質(zhì)初生肽鏈上的糖結(jié)構(gòu)稱為G寡糖,它由兩個葡糖酰胺,9個甘露糖和3個葡萄糖組成(Glc3Man9GlcNAc2)。G寡糖加在肽鏈特定序列(Asn-X-Ser或Asn-X-Thr)的天冬酰胺上,然后在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以及高爾基體一系列酶的作用下剪切成最終結(jié)構(gòu)[10]。

    肽鏈上的G寡糖依次經(jīng)過葡萄糖苷酶I和葡萄糖苷酶Ⅱ的酶切作用形成Glc1Man9GlcNAc2結(jié)構(gòu),該結(jié)構(gòu)可以被內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上類分子伴侶CNX以及其位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中的同源蛋白CRT識別。CNX/CRT能夠大量招募幫助蛋白質(zhì)折疊的分子伴侶,如蛋白二硫鍵異構(gòu)酶(Protein disulfide isomerases,PDIs)可以形成或者斷裂分子內(nèi)以及分子間二硫鍵,既保證了蛋白質(zhì)的正確折疊又避免蛋白質(zhì)凝聚。因此,進(jìn)入CNX/CRT循環(huán)的糖蛋白可以在多種分子伴侶幫助下進(jìn)行折疊,同時,在CNX/CRT循環(huán)中糖鏈的最后一個葡萄糖繼續(xù)被葡萄糖苷酶Ⅱ剪切[11-12]。如果肽鏈能夠完成正確折疊,則保留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng),或被分泌出內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)入高爾基體;如果肽鏈沒有完成正確折疊,則在UDP葡萄糖糖蛋白糖基轉(zhuǎn)移酶(UDP-glucose:glycoprotein glucosyltransferase,UGGT)的作用下重新加上一個葡萄糖分子,繼續(xù)在CNX/CRT循環(huán)中進(jìn)行再折疊[13]。UGGT是一個定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔的蛋白,其N端結(jié)構(gòu)可以和非正確折疊的蛋白結(jié)構(gòu)結(jié)合,C端是糖基轉(zhuǎn)移酶催化結(jié)構(gòu)域。作為蛋白折疊狀態(tài)的檢測員,UGGT能夠保證蛋白質(zhì)最大可能完成折疊。然而,CNX/CRT并不是無限循環(huán)的,如果蛋白質(zhì)最終仍然不能得到其正確構(gòu)象,蛋白也會從循環(huán)中分離。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)1,2-甘露糖苷酶I和EDEM(酵母中為Htm1)的催化下切掉側(cè)鏈上的兩個甘露糖,形成能被ERAD系統(tǒng)組分OS9識別的α-1,6糖苷鍵,最終錯誤折疊蛋白通過ERAD系統(tǒng)清除[14-15]。到目前為止,錯誤折疊蛋白經(jīng)過多久的再折疊循環(huán)后才從CNX/CRT循環(huán)中脫離還不清楚。

    由于其功能的重要性,ERQC系統(tǒng)在高等生物中高度保守。在植物中已經(jīng)鑒定到了多個參與ERQC和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中糖基化修飾相關(guān)的蛋白,并且由于植物要適應(yīng)各種復(fù)雜生存環(huán)境,植物中ERQC的同源蛋白數(shù)目一般不止一個。在擬南芥中,CNX有兩個拷貝,而CRT有3個同源蛋白。研究顯示,在正常生長條件下,cnx1 cnx2雙突變體以及crt1 crt2 crt3三突變體均沒有明顯表型,而cnx1 crt1 crt2 crt3四突變體表現(xiàn)出植株矮小,主根變短,根毛變密以及花粉活力變差,花粉管生長異常等表型。但是有意思的是,cnx2 crt1 crt2 crt3并沒有表現(xiàn)出類似的表型,但是CNX2能夠恢復(fù)cnx1 crt1 crt2 crt3突變體一系列生長異常的表型。說明CNX1和CNX2存在功能冗余,但是CNX1比CNX2作用更強(qiáng)。如果CNX/CRT循環(huán)中的5個基因同時功能缺失,則會導(dǎo)致植物致死[16]。植物甾醇受體BRI的突變體形式bri1-9和bri1-5被證實(shí)是ERAD的底物,正常的BRI蛋白在質(zhì)膜上接受信號,而突變形式的bri1-9和bri1-5積累在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中,導(dǎo)致植物出現(xiàn)生長矮小的表型[17]。如果ERAD途徑受阻,大量的bri1-9/ bri1-5在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中積累并溢出到質(zhì)膜,接收信號后植物能夠恢復(fù)表型。通過篩選恢復(fù)bri1-9矮小表型的基因,篩選到了CRT3,crt3 bri1-9雙突變體能夠很好地恢復(fù)bri1-9 生長矮小的表型[18]。

    UGGT在擬南芥中只有一個同源蛋白,uggt突變體植物中以UDP-葡萄糖為底物的糖基轉(zhuǎn)移酶活性明顯下降,同時突變體植物表現(xiàn)出明顯的生長矮小,主根變短表型。在uggt突變體中,BiP1/2、BiP3、PDIL等UPR響應(yīng)基因的表達(dá)明顯上調(diào),說明在沒有外源ER stress時,UGGT突變能夠誘導(dǎo)UPR 的產(chǎn)生[19]。

    哺乳動物中α-甘露糖苷酶EDEM在擬南芥中的同源家族有5個成員,分別稱為MNS1-5,其中MNS1和MNS2是高爾基體甘露糖苷酶,MNS3是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)甘露糖苷酶,在MNS1/2的上游發(fā)揮作用。在MNS1-3的作用下,寡糖由Man9GlcNAc2結(jié)構(gòu)剪切為 Man5GlcNAc2結(jié)構(gòu)[20]。MNS4和 MNS5是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位的蛋白質(zhì),對折疊正確的分泌蛋白上的甘露糖沒有作用,通過煙草瞬時表達(dá)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),它們能夠順利剪切內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留的錯誤折疊糖蛋白上的甘露糖,產(chǎn)生被ERAD系統(tǒng)識別的α-1,6糖苷鍵,說明MNS4和MNS5參與擬南芥ERQC過程[21]。同時,mns4 mns5突變體表現(xiàn)出對鹽脅迫處理敏感的表型。植物中越來越多的研究使得植物蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的加工折疊過程越來越明朗,其中大部分過程和酵母,動物中的研究是高度保守的。

    2 非折疊蛋白應(yīng)答(UPR)

    錯誤折疊蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的大量積累會誘導(dǎo)UPR的產(chǎn)生。UPR過程也是酵母、動物以及植物領(lǐng)域保守存在但具體的作用機(jī)制又有所差異的。酵母中的UPR只有一條通路,由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白 IRE1p(Inositol-Requiring Transmembrane Kinase/Endonuclease p)介導(dǎo)。在動物UPR中除了IRE1外還存在另外兩條通路,分別是ATF6和PERK通路。熱激蛋白HSP70家族成員BiP起著調(diào)控3個跨膜受體活性的作用。BiP蛋白由N端的ATP酶活結(jié)構(gòu)域和C端的肽段結(jié)合結(jié)構(gòu)域組成,其與錯誤折疊蛋白暴露的疏水殘基之間的結(jié)合受ATP酶活調(diào)控。在沒有受脅迫的細(xì)胞中,BiP和這3個受體結(jié)合,抑制它們的活性;而在受到脅迫時,BiP即與3個受體解離,受體被激活[22-23]。

    IRE1是一個約100 kD的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜定位蛋白,該蛋白主要由核糖核酸酶結(jié)構(gòu)域和激酶結(jié)構(gòu)域組成,在動物中存在兩個同源蛋白,分別是IRE1α和IRE1β。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)的部分與BiP相互作用并在受到脅迫時解離。解離以后 IRE1 首先通過自身激酶活性進(jìn)行自身磷酸化,進(jìn)而形成同源二聚體,完成自身激活。激活的 IRE1 通過其核糖核酸酶活性剪切掉XBP1u中一個約26個核苷酸的內(nèi)含子,形成XBP1s,通過XBP1s發(fā)揮緩解ER stress的功能[24]。另一方面,近來的研究顯示,沒有脅迫出現(xiàn)時,IRE1α作為ERAD底物被調(diào)控,并且BiP參與了該過程[25]。脅迫出現(xiàn)后,BiP與IRE1α解離,IRE1α蛋白質(zhì)穩(wěn)定性增強(qiáng),發(fā)揮UPR功能。以上研究說明BiP可以從活性和蛋白質(zhì)穩(wěn)定性兩方面調(diào)控IRE1α[25]。

    ATF6 是一個90 kD大小的蛋白,定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上。在動物中也存在兩個同源蛋白,分別是ATF6α 和 ATF6β。研究認(rèn)為 ATF6α 在緩解 ER stress中發(fā)揮著更重要的作用。與IRE1類似,在沒有脅迫時,ATF6和BiP相互作用;一旦出現(xiàn)脅迫,BiP與ATF6解離,ATF6激活且定位從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)移到高爾基體中。ATF6 在高爾基體中接受進(jìn)一步的膜內(nèi)蛋白剪切,首先被絲氨酸蛋白酶位點(diǎn)1(S1P)剪切,隨后被金屬蛋白酶位點(diǎn)2(S2P)剪切。經(jīng)過兩步剪切,ATF6 由原來的90 kD變成只具有50 kD大小轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域的蛋白并進(jìn)入細(xì)胞核中,通過調(diào)控 UPR 相關(guān)基因或者 ERAD 組分基因的表達(dá),發(fā)揮緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫的作用[26]。

    PERK的激活類似于IRE1,也是與BiP解離后形成二聚體并自我激活?;罨蟮腜ERK可以進(jìn)一 步 磷 酸 化 eIF2α(Eukaryotic translation Initiation Factor 2α),磷酸化的eIF2α繼續(xù)保持與eIF2B的結(jié)合因而不能與GDP結(jié)合,造成翻譯不能正常進(jìn)行。因此,減少了進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白量,達(dá)到緩解ER stress的目的[27]。

    植物中的UPR主要有兩條通路,一條是類似于IRE1的bZIP60轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)的通路,另外一條是類似于ATF6的bZIP28轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)的通路。目前植物中還沒有動物中PERK同源基因被報道,但是除了膜定位的bZIP類轉(zhuǎn)錄因子外,植物特有的NAC轉(zhuǎn)錄因子也參與到緩解ER stress中。2011 年,Deng等[7]發(fā)現(xiàn)Tm和DTT等ER stress誘導(dǎo)劑可以誘導(dǎo)bZIP60發(fā)生mRNA剪切。bZIP60的mRNA在跨膜域上游被剪切掉23 bp,新組合序列編碼的蛋白在剪切識別位點(diǎn)下游有兩個預(yù)測的核定位信號[7]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)IRE1在bZIP60的剪切中發(fā)揮功能。IRE1在擬南芥中有兩個同源蛋白,分別稱為IRE1a和 IRE1b。Nagashima等[28]發(fā)現(xiàn)在 ire1b單突變體中bZIP60的剪切幾乎不受影響;而在ire1a/ire1b雙突變體中,bZIP60的剪切完全消失,說明植物中IRE1a和IRE1b在負(fù)責(zé)bZIP60的剪切上存在功能冗余。bZIP60和XBP1序列同源性不高,但都具有雙莖環(huán)結(jié)構(gòu),對其成功剪接非常重要。

    與bZIP60在mRNA水平進(jìn)行活化不同,bZIP17/28在蛋白質(zhì)水平進(jìn)行活化。bZIP17/28 均是定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的轉(zhuǎn)錄因子,與 ATF6 序列相似性雖然不高,但是在結(jié)構(gòu)域排列上有相似性。例如,在朝向細(xì)胞質(zhì)側(cè)的N端有一個預(yù)測的bZIP結(jié)構(gòu)域,并且在朝向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔的C端有一個S1P酶切位點(diǎn)。bZIP17和bZIP28的作用機(jī)制相似,以下以bZIP28為例來說明。與 ATF6 不同,bZIP28 的激活雖然也受到了 BiP 的影響,但是并不直接與 BiP 相關(guān)。正常情況下,bZIP28 通過與 BiP 相互作用滯留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。當(dāng)體內(nèi)錯誤折疊的蛋白積累時,這些錯誤折疊蛋白競爭性的與 BiP 相互作用,因此使bZIP28從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)得到釋放[29-31]。而bZIP28本身在細(xì)胞質(zhì)側(cè)靠近跨膜域的部分,以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)均有高爾基體定位信號[32-33]。當(dāng)被釋放的bZIP28從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)移到高爾基體后被S1P和S2P兩個酶剪切,使包含DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域的蛋白胞質(zhì)側(cè)從膜系統(tǒng)脫離進(jìn)入細(xì)胞核,調(diào)控相應(yīng)脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)[34-36]。研究顯示不僅TM和DTT這類典型的ER stress誘導(dǎo)物能誘導(dǎo)bZIP28的活化途徑,環(huán)境脅迫比如熱脅迫也能夠發(fā)揮作用[37-39]。此外,鹽脅迫能夠誘導(dǎo)bZIP17發(fā)生類似的活化過程[5]。

    NAC 類轉(zhuǎn)錄因子是植物中特有的一類轉(zhuǎn)錄因子。近期研究表明,NAC062和NAC089均可以受到ER stress的誘導(dǎo)表達(dá),面對ER stress,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位的NAC089和質(zhì)膜定位的NAC062會轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi),在植物的 UPR 中發(fā)揮重要作用[40-41]。它們均是二類單次跨膜膜蛋白,與bZIP28在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)還有大的蛋白結(jié)構(gòu)域不同,NAC062和NAC089僅通過C末端插在膜上,功能結(jié)構(gòu)域均位于胞質(zhì)側(cè)。因此目前關(guān)于二者是如何定位到細(xì)胞核的具體機(jī)制還不甚清晰。CHIP-qPCR結(jié)果顯示NAC062在一些UPR響應(yīng)基因如BiP2的啟動子區(qū)域富集。下調(diào)體內(nèi)NAC062時,植物表現(xiàn)對脅迫敏感,而在bzip28/bzip60雙突背景下過表達(dá)核定位的NAC062DMyc時植物對脅迫表現(xiàn)出抗性[41]。冷脅迫也可以誘導(dǎo)NAC062的核定位[42]。關(guān)于植物體內(nèi)的UPR系統(tǒng)除了膜相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子外可能還有更多蛋白參與其中,相信隨著研究的深入會有更多參與因子被發(fā)掘,同時,更詳細(xì)的功能機(jī)制也會被解析。

    為了緩解 ER stress,直接將錯誤折疊蛋白清除對于生物體同樣至關(guān)重要。那么接下來就介紹參與這個過程的重要因子:ERAD和ERQC autophagy。這兩個途徑的主要區(qū)別是ERAD機(jī)制將錯誤折疊蛋白底物反轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)然后進(jìn)行泛素化修飾,最后通過細(xì)胞質(zhì)的26S蛋白酶體清除[43];而集聚在一起不能被反轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中的錯誤折疊蛋白或者不能被ERAD降解的蛋白質(zhì)則通過ERQC autophagy途徑降解[44-45]。首先總結(jié)ERAD途徑的研究進(jìn)展。

    3 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的蛋白質(zhì)降解

    ERAD 系統(tǒng)有效的行使其功能對于細(xì)胞正常的生命活動非常重要[43,46]。在人中,ERAD 與一些疾病相關(guān),如帕金森綜合癥。Parkin 蛋白是一個 RING-type 的 E3 連接酶,家族性帕金森綜合癥患者的致病原因之一是 Parkin 蛋白的突變,突變的Parkin 喪失了 E3 活性,不能有效緩解錯誤折疊蛋白積累造成的脅迫,這種脅迫持續(xù)的積累會產(chǎn)生神經(jīng)毒性,從而造成帕金森綜合癥[47]。植物中ERAD也與耐受逆境脅迫過程有關(guān),研究工作表明用300 mM NaCl處理野生型擬南芥6 h后,BiP、CNX1的表達(dá)量均明顯上調(diào)[48]。除了在降解這些錯誤折疊蛋白中發(fā)揮作用外,研究顯示ERAD在正常的生長發(fā)育過程中也發(fā)揮著重要的作用。哺乳動物中,UBE2J1功能缺失會導(dǎo)致小鼠精子發(fā)育缺陷,從而影響生育[49]。同樣在小鼠體內(nèi)敲除SEL1L,能夠引起小鼠體內(nèi)脂類代謝的異常,最終導(dǎo)致小鼠體重下降[50]。而在植物當(dāng)中,通過比較番茄成熟缺陷突變體rin和野生型差異表達(dá)蛋白發(fā)現(xiàn)了一個與酵母ERAD中Ubc6p同源的番茄UBC32,該基因的功能缺失導(dǎo)致番茄果實(shí)晚熟[51]。綜上所述,ERAD過程中的組分蛋白既可以在外界脅迫存在的情況下,通過降解錯誤折疊蛋白來緩解ER stress,同時也在動植物的正常生長發(fā)育中發(fā)揮重要功能。

    ERAD過程主要由四步組成:(1)對錯誤折疊蛋白的識別;(2)位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的蛋白質(zhì)反轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì);(3)在特定的E1,E2和E3連接酶作用下進(jìn)行泛素化修飾;(4)由26S蛋白酶體降解。對錯誤折疊蛋白的識別主要涉及兩種,一種是對錯誤折疊糖蛋白的識別,這種識別主要依賴于糖蛋白經(jīng)過剪切后暴露的α-1,6糖苷鍵。OS9(植物中是AtOS9)結(jié)合α-1,6糖苷鍵后通過與SEL1L(植物中HRD3A)互作將底物拉進(jìn)HRD1復(fù)合體。另一種是對非糖蛋白的識別,通過BiP識別錯誤折疊蛋白暴露的疏水肽段完成。蛋白與BiP結(jié)合后并不進(jìn)入CNX/CRT循環(huán),而是被其傳遞給二硫鍵還原酶ERdj5,進(jìn)而傳遞給SEL1L進(jìn)入ERAD系統(tǒng)[52-53]。如果將糖蛋白的糖鏈加工過程進(jìn)行人為抑制,那么糖蛋白也會通過BiP識別進(jìn)入ERAD降解系統(tǒng)[52]。擬南芥中已證實(shí)AtOS9參與ERAD過程,atos9突變體表現(xiàn)出對鹽脅迫和衣霉素處理敏感的表型,并且atos9 bri1-9/ atos9 bri1-5能夠恢復(fù)bri1-9/ bri1-5生長矮小的表型。但是AtOS9并不能恢復(fù)酵母中OS9p對于底物CPY*的降解,說明植物中和酵母中OS9在介導(dǎo)不同的底物中發(fā)揮作用[54-55]。

    大部分經(jīng)過ERAD系統(tǒng)清除的錯誤蛋白都是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔蛋白或者內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白,這部分蛋白需要轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中才能被細(xì)胞質(zhì)中的蛋白酶體降解。目前關(guān)于反轉(zhuǎn)運(yùn)通道研究成熟的主要有3種。一種是SEC61轉(zhuǎn)運(yùn)通道,關(guān)于SEC61,我們更熟悉的是其作為通道介導(dǎo)分泌蛋白進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。但是酵母和動物中的研究表明缺失SEC61可以使多個ERAD底物蛋白,如酵母配對信息素pαF、細(xì)菌毒素的催化亞基等穩(wěn)定性增強(qiáng)[56-57]。此外,酵母中的DER1(動物中為Derlin1)也認(rèn)為在底物轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮重要功能。DER1缺失可以完全阻止CPY*和PrA*的降解[58]。但是DER1只有四個跨膜域,很難單獨(dú)發(fā)揮通道功能,因此更認(rèn)為它作為通道的重要組成部分。第三種通道即是介導(dǎo)底物蛋白泛素化修飾的E3連接酶,研究表明HRD1通常通過跨膜域與底物蛋白互作,并介導(dǎo)底物蛋白的反轉(zhuǎn)運(yùn)[59-60]。擬南芥中的E2 UBC32是HRD1的底物,研究顯示UBC32與HRD1互作即是通過跨膜域?qū)崿F(xiàn)[61]。

    反轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)后即進(jìn)行底物的泛素化修飾。有一類特殊的E2和E3介導(dǎo)ERAD底物的降解。在酵母中有兩個E3連接酶,分別為Hrd1p和Doa10p,E2分別有Ubc6p和Ubc7p。動物中目前已經(jīng)報道的參與ERAD的E3有16個,而Ubc6p在人類細(xì)胞中的同源蛋白有UBE2J1和UBE2J2;Ubc7p在人類細(xì)胞中的同源蛋白有UBE2G1和UBE2G2。植物中已經(jīng)報道的有E3連接酶HRD1、DOA10及Rma1,接頭蛋白HRD3A,泛素結(jié)合酶UBC32等。HRD1復(fù)合體中的HRD1蛋白,HRD3A以及AtOS9在擬南芥中均已有報道。HRD1在擬南芥中有兩個功能冗余的同源蛋白HRD1A和HRD1B。雙突變體表現(xiàn)出衣霉素處理敏感的表型,并且HRD1通過直接介導(dǎo)UBC32的泛素化參與ERAD活性的調(diào)節(jié)[61]。hrd3a突變體對鹽、百草枯等一系列處理均是超敏感的,并且突變體體內(nèi)積累更多的ROS[48],在其突變體中過表達(dá)UPR相關(guān)基因bZIP17,bZIP28,bZIP60可以彌補(bǔ)hrd3a突變造成的脅迫表型[62]。通過篩選干旱敏感突變體dry2的抑制子得到SUD1(Suppressor of dry2 defects1),SUD1即酵母中Doa10p的同源蛋白。突變的DOA10(SUD1)能夠顯著恢復(fù)dry2干旱敏感的表型,但是DOA10只能下調(diào)羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶(HMG-CoA)的活性并不影響HMGCoA的蛋白穩(wěn)定性[8]。此外,doa10突變體在ABA上表現(xiàn)出超敏感表型,突變體干種子中的ABA含量明顯增高,添加ABA抑制劑后突變體表型得到恢復(fù)。因此,DOA10是ABA合成和信號通路中的負(fù)調(diào)控因子[63]。而最近又有研究報道doa10hrd1ahrd1b三突變體對熱激處理表現(xiàn)不敏感表型[64]。已報道的動物中參與ERQC、UPR、ERAD相關(guān)基因在擬南芥中的同源基因見表1,相信隨著植物領(lǐng)域ERAD研究的深入,越來越多的ERAD組分以及這些組分參與的生物學(xué)過程被發(fā)掘。

    鑒于ERAD系統(tǒng)如此重要,ERAD活性受到了生命體的精細(xì)調(diào)控。如果體內(nèi)的 ERAD 活性紊亂,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的 ERAD 組分含量過高,當(dāng)ERAD 總體活性過高時,就會非特異性的識別一些蛋白折疊中間體,將這些正在折疊中的蛋白作為錯誤折疊蛋白降解,這顯然對生物體是不利的。在這種情況下,細(xì)胞通過降解體內(nèi) ERAD 組分使 ERAD 活性保持在一個較低水平,進(jìn)而保證細(xì)胞內(nèi)的蛋白正確折疊的過程,這種機(jī)制就稱為 ERAD平衡(ERAD tuning)[65]。被調(diào)控的這些 ERAD組分本身又是發(fā)揮功能的組分,如果細(xì)胞遭受外來侵害而使細(xì)胞內(nèi)錯誤折疊蛋白增多,這些蛋白又會穩(wěn)定下來發(fā)揮其相應(yīng)的功能。因此,ERAD tuning 活性是受體內(nèi)錯誤折疊蛋白水平調(diào)控的。但是目前脅迫使 ERAD 組分穩(wěn)定的具體機(jī)制研究還非常少見。一種假設(shè)認(rèn)為,錯誤折疊蛋白可能在這個過程中起到重要作用。在錯誤折疊蛋白很少的情況下,ERAD 組分大部分處于未組裝的狀態(tài),因此使某些組分被降解;而大量錯誤折疊蛋白存在時,可以促使 ERAD 組分組裝,形成有功能的ERAD 機(jī)器,同時保護(hù)那些原來被降解的組分不再被降解。最近一篇關(guān)于 HRD1 介導(dǎo)IRE1 降解的文章介紹,脅迫可以很大程度上減弱HRD1 與 IRE1 之間的相互作用。另外,脅迫處理與不處理?xiàng)l件下,胰蛋白酶對 IRE1 的剪切帶型也不同,因此,作者認(rèn)為脅迫可能從影響蛋白相互作用和改變構(gòu)象兩方面使 ERAD 組分穩(wěn)定[24]。脅迫消除后,被過量誘導(dǎo)表達(dá)的各種伴侶分子和 ERAD 組分需要被清除掉,分子伴侶的消除時間更長,如 PDI、BIP、CNX 等的半衰期均大于 24 h。而 ERAD 組分的消除時間相對較快。因此,ERAD tuning 在面對脅迫時對 ERAD 活性的調(diào)節(jié)相比UPR更加迅速,同時UPR一部分下游基因編碼ERAD相關(guān)蛋白。但是目前關(guān)于ERAD平衡的研究還很少。Chen等[61]最近發(fā)現(xiàn)UBC32的蛋白穩(wěn)定性受脅迫處理的調(diào)控,在沒有脅迫時HRD1可以直接介導(dǎo)UBC32通過蛋白酶體途徑降解;脅迫處理時,UBC32穩(wěn)定性增強(qiáng)。并且HRD1對UBC32的調(diào)控在動物細(xì)胞中保守存在。同時,他們還發(fā)現(xiàn)UBC32可以負(fù)調(diào)控HRD1復(fù)合體中的AtOS9,通過相互調(diào)控實(shí)現(xiàn)ERAD活性的平衡[66]。而這個結(jié)果也和動物中OS9在UBE2J1突變體中積累的結(jié)果是一致的,說明ERAD平衡像ERAD過程一樣在高等生物中保守存在。

    4 ERQC自噬途徑(autophagy)

    很多內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的蛋白由于本身是膜蛋白,多個蛋白分子集聚到一起后體積較大,不能反轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中由蛋白酶體來降解,這些蛋白一般由另外一種重要的調(diào)控蛋白穩(wěn)定性的途徑——自噬途徑降解。但是目前植物中相關(guān)領(lǐng)域研究還很少,動物中有較多報道,如α1抗胰蛋白酶Z(ATZ)是α1抗胰蛋白酶的一個點(diǎn)突形式,ATZ能夠影響蛋白的正常糖基化,形成不可溶的聚集體。由于其不能反轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中,因此會通過類內(nèi)吞的作用形成自噬體,進(jìn)而通過自噬途徑降解。這個過程不需要泛素化修飾,也沒有ERAD相關(guān)組分參與[67]。Houck等[45]在2014年報道某些蛋白是可溶的,但是由于其不能被ERAD底物識別系統(tǒng)識別,也會通過ERQC autophagy途徑降解。如一種G蛋白偶聯(lián)受體GnRHR,其部分折疊的突變形式E90K在蛋白酶體抑制劑處理時不受影響,而在自噬途徑抑制劑處理時蛋白積累。作者認(rèn)為這是因?yàn)椴糠皱e誤折疊使ERAD識別系統(tǒng)不能很好地識別該底物,從而誘導(dǎo)了自噬途徑。完全錯誤折疊的突變體蛋白S168R主要是通過蛋白酶體途徑降解,但是如果將ERAD途徑阻止,S168R就會進(jìn)入ERQC autophagy途徑。以上兩種自噬都是不依賴于泛素化修飾的,而有一類選擇性自噬途徑依賴于泛素化修飾,然后由一個中間受體介導(dǎo)進(jìn)入自噬途徑。這個中間受體需要同時具有泛素結(jié)合域和LC3(定位于自噬體)結(jié)合域,目前已經(jīng)知道的有SQSTM1/P62,NBR1等。2017年Feng等[68]報道HRD1可以介導(dǎo)SERPINAE342K進(jìn)行K48位的泛素化修飾,部分通過蛋白酶體途徑降解,而另外大部分則通過SQSTM1/P62介導(dǎo)的選擇性自噬途徑降解。

    研究顯示在擬南芥中ER stress可以誘導(dǎo)自噬過程,進(jìn)而造成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜及內(nèi)含物的降解。其中IRE1b在該過程中發(fā)揮重要作用,而同源基因IRE1a沒有此作用[69]。進(jìn)一步研究揭示了ER stress造成的積累的錯誤折疊蛋白作為信號激活了自噬過程[70]。雖然目前植物領(lǐng)域這部分詳細(xì)的報道還較少,但是鑒于植物領(lǐng)域近幾年的蓬勃發(fā)展我們相信在不久的將來肯定會有更多相關(guān)報道。圖1總結(jié)了動植物中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)質(zhì)量檢測系統(tǒng)過程。

    圖1 動植物中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)質(zhì)量監(jiān)控系統(tǒng)

    5 展望

    目前關(guān)于ERAD的研究仍然是酵母和動物領(lǐng)域研究的最詳盡,植物中的相關(guān)研究是近幾年才逐漸增多。植物整個生命過程中受到精細(xì)的激素調(diào)控,同時也會遭受各種生物或非生物脅迫,解析ERAD如何在植物面對脅迫時發(fā)揮功能是非常重要的。雖然已經(jīng)報道ERAD參與鹽脅迫,熱脅迫以及ABA信號通路等過程,但是距離解析ERAD在更多脅迫或者激素信號中詳細(xì)的作用機(jī)理還有很大距離。此外,自噬途徑與ERAD介導(dǎo)的蛋白酶體途徑在介導(dǎo)底物降解之間的協(xié)同合作方面的研究在植物領(lǐng)域也知之甚少,值得科學(xué)家投入更多精力進(jìn)行研究,對這些問題的深入研究將有助于我們進(jìn)一步揭示ERAD調(diào)控植物生長發(fā)育的奧秘。

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