4株羊瘤胃功能性細(xì)菌的篩選

崔小蕾， 王紅英， 李陽陽， 錢斯日古楞

(大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，遼寧 大連 116034)

抗生素以飼料添加劑的形式在養(yǎng)殖業(yè)中有廣泛的應(yīng)用，使用抗生素能讓牲畜在抗病、防病方面獲得良好的效果，但也導(dǎo)致牲畜體內(nèi)病原體耐藥性的提高和抗生素在食品中殘留的問題[1]。隨著人們不斷地發(fā)現(xiàn)抗生素帶來的諸多負(fù)面作用，抗生素被越來越多的國家在動物飼料中禁止使用[2]。因此尋找可代替抗生素產(chǎn)品的研發(fā)和應(yīng)用勢在必行。“益生菌”一詞被定義為活的微生物飼料添加劑，通過改善動物腸道內(nèi)微生物系統(tǒng)的平衡，達(dá)到對動物產(chǎn)生有益效果的目的[3]，可作為抗生素替代物。其主要作用是促進(jìn)動物對致病菌的抵抗能力，加強(qiáng)宿主腸道內(nèi)壁黏膜的屏障作用，減少致病菌侵入動物組織內(nèi)，改善其健康狀態(tài)[4]。同時，益生菌還能維持腸道菌群平衡，預(yù)防幼畜疾病，減少有害氣體的產(chǎn)生，凈化環(huán)境，改善畜產(chǎn)品品質(zhì)，生產(chǎn)出無公害產(chǎn)品，并節(jié)省飼料，降低成本，提高經(jīng)濟(jì)效益[5-6]。反芻動物瘤胃內(nèi)分布著多種微生物，包括瘤胃原蟲、細(xì)菌、真菌和古細(xì)菌等，這些微生物在動物腸道中相互制約，相互促進(jìn)，進(jìn)行復(fù)雜的生理活動，參與動物體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的降解和吸收過程，從而促進(jìn)動物機(jī)體的生長[7]。動物胃腸道微生物菌群不僅促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，促進(jìn)生長，同時菌體產(chǎn)生大量的抗體，能維持機(jī)體免疫系統(tǒng)處于激活狀態(tài)[8]，使微生物與自身免疫系統(tǒng)相互作用，逐漸達(dá)到動物腸道與免疫系統(tǒng)的穩(wěn)定[9]。目前國內(nèi)外的研究，主要集中在羊瘤胃液提取物制備飼料添加劑及其應(yīng)用等，而從羊瘤胃自然菌群中篩選出功能性菌，并對其產(chǎn)酶特性進(jìn)行研究和未來開發(fā)利用微生態(tài)制劑的研究非常有限[10]。本研究從羊瘤胃菌群中篩選出具有產(chǎn)纖維素酶、蛋白酶或淀粉酶的細(xì)菌菌株，并對它們的形態(tài)特征和對指示菌的抑菌效能進(jìn)行檢測。希望該成果對反芻動物微生態(tài)制劑的開發(fā)提供菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 篩選菌種來自大連地區(qū)圈養(yǎng)的2歲綿羊的瘤胃內(nèi)容物。大腸埃希菌ATCC25922 (EscherichiacoliATCC25922)、副溶血弧菌ATCC17802 (VibrioparahemolyticusATCC17802)、藤黃八疊球菌HY78 (SarcinaluteaHY78)和產(chǎn)氣桿菌AS1489 (AerogenesAS1489 )等指示菌均由遼寧檢驗(yàn)檢疫局動物檢驗(yàn)所提供。

1.1.2 培養(yǎng)基 富集培養(yǎng)基：葡萄糖 10.0 g，蛋白胨 5.0 g，磷酸二氫鉀 1.0 g，硫酸鎂0.5 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 6.0；細(xì)菌分離純化培養(yǎng)基：牛肉膏 5.0 g，蛋白胨 10.0 g，氯化鈉 5.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH 5.5～6.0，瓊脂20.0 g；LB培養(yǎng)基：蛋白胨 10.0 g，酵母浸出汁 5.0 g，氯化鈉 10.0 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 7.5。

1.2 方法

1.2.1 菌種的富集培養(yǎng) 取4 mL用4層紗布過濾的羊瘤胃液，混入富集培養(yǎng)基中，在37 ℃厭氧培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)2 d。

1.2.2 菌種的分離與純化 將富集培養(yǎng)液用無菌水進(jìn)行梯度稀釋至10-1～10-10的不同菌懸液。從不同稀釋液中分別吸取200 μL，涂布在分離純化培養(yǎng)基上，37 ℃厭氧培養(yǎng)2 d。挑出單個菌落在另外分離純化培養(yǎng)基上劃線，37 ℃繼續(xù)厭氧培養(yǎng)2 d，反復(fù)操作至出現(xiàn)單菌落。單菌落菌體用試管斜面在4 ℃保藏，備用。

1.2.3 篩選產(chǎn)酶特性的瘤胃功能性細(xì)菌 ①產(chǎn)生纖維素酶特性：采用剛果紅脫色法，在纖維素選擇性培養(yǎng)基上篩選出產(chǎn)纖維素酶的菌株[11]。利用DNS法測定纖維素酶酶活，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)物制備標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=0.684 4x-0.004 3)[12-13]。纖維素酶酶活按公式(1)計算。

(1)

式中b和a為由葡萄糖濃度和相應(yīng)的OD值通過回歸方程求得；x為樣品OD值的平均值；n為酶粉(液)的稀釋倍數(shù)；T為酶促反應(yīng)時間(min)；0.5為所加酶液的量(0.5 mL)；180為葡萄糖相對分子質(zhì)量。酶活定義為，在pH 4.6條件下，1 mL酶液水解底物1 min產(chǎn)生1 μmol還原糖所用的酶量為1個酶活力單位(U/mL)。②產(chǎn)生淀粉酶特性：利用碘與淀粉變藍(lán)的原理，在淀粉選擇性培養(yǎng)基上用碘液煤染法挑選出產(chǎn)淀粉酶的菌株[14]。淀粉酶酶活的測定按1.2.3①中的纖維素酶酶活測定方法進(jìn)行。③產(chǎn)生蛋白酶特性：在肉湯培養(yǎng)基中加入干酪素，培養(yǎng)菌株，最后挑選出具有透明圈的菌落菌株為產(chǎn)蛋白酶的菌株。利用福林酚法測得菌株產(chǎn)蛋白酶的酶活，酪氨酸為標(biāo)準(zhǔn)物制備標(biāo)準(zhǔn)曲線(y = 0.901 5x-0.019 5)[15-16]。蛋白酶的酶活按公式(2)計算。

(2)

式中A為標(biāo)準(zhǔn)曲線中OD值為1時所對應(yīng)的酪氨酸的量；x為樣品平行試管的平均吸光度；4為試管中反應(yīng)液總體積(4 mL)；n為酶液稀釋的倍數(shù)；10為反應(yīng)時間10 min。酶活定義為，在40 ℃下每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸，定義為1個蛋白酶活力單位(U/mL)。

1.2.4 抑菌特性篩選的瘤胃功能性細(xì)菌 ①菌體活化：將篩選到的菌株及4種指示菌分別接種于LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃、120 r/min搖床培養(yǎng)24 h，進(jìn)行活化。②抑菌特性的檢測：將稀釋好的4種指示菌均勻涂布在LB固體培養(yǎng)基上。將篩選的不同菌株分別發(fā)酵培養(yǎng)24 h后，離心取上清液200 μL至LB固體培養(yǎng)基上的牛津杯中， 30 ℃培養(yǎng)24 h，觀察對指示菌的抑菌效果，挑選出具有抑菌作用的菌種[17-19]。

1.2.5 篩選菌種的形態(tài)特征 通過對菌株進(jìn)行產(chǎn)酶特性和抑菌特性的研究，選出優(yōu)異菌株C5、C9、C12、C13，并對其形態(tài)特征進(jìn)行電子掃描顯微鏡觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 瘤胃功能性細(xì)菌的產(chǎn)酶特性

2.1.1 產(chǎn)纖維素酶特性 經(jīng)菌體篩選從羊瘤胃菌群中分離得到16種菌株，分別編號為菌株C1～C16。采用剛果紅脫色法發(fā)現(xiàn)，除了菌株C2、C9、C14外，其余菌株均產(chǎn)纖維素酶，酶活測定結(jié)果見圖1。由圖1可見，菌株C3、C4、C5、C8、C12、C13產(chǎn)纖維素酶的酶活高于其他菌株，其中菌株C13的纖維素酶酶活最高，達(dá)到3.59 U/mL。該結(jié)果與張麗萍等[20]在牛瘤胃中篩出的細(xì)菌菌株產(chǎn)纖維素酶的酶活(3.72 U/mL)活性較為接近。

圖1 篩選菌株產(chǎn)纖維素酶的活性Fig.1 Enzyme activity of cellulase produced from strains screened

2.1.2 產(chǎn)淀粉酶特性 經(jīng)淀粉選擇性培養(yǎng)基鑒定得出，除菌株C1、C3、C4、C8、C14、C16外，其余菌株均產(chǎn)淀粉酶，結(jié)果見圖2。由圖2可見，菌株C2、C5、C6、C9、C12產(chǎn)淀粉酶的酶活較高，其中菌株C5的淀粉酶酶活最高，達(dá)23.37 U/mL，且菌株C2、C6、C9、 C12的酶活均高于10 U/mL以上。這個數(shù)據(jù)與徐穎等[21]在淀粉廠周邊的土壤中篩出的細(xì)菌菌株產(chǎn)淀粉酶酶活(20.83 U/mL)活性比較，活性較高。

圖2 篩選菌株產(chǎn)淀粉酶的酶活Fig.2 Enzyme activity of amylase produced from strains screened

2.1.3 產(chǎn)蛋白酶特性 經(jīng)蛋白酶鑒定培養(yǎng)基的培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，除菌株C1、C3、C4、C10、C14、C16外，其余菌株產(chǎn)蛋白酶明顯，酶活測定結(jié)果見圖3。由圖3可見，除菌株C2產(chǎn)蛋白酶的酶活較低外，其余菌株產(chǎn)蛋白酶的酶活均較高，其中菌株C5產(chǎn)酶酶活最高，達(dá)46.82 U/mL,與李嬋娟等[22]在土壤中篩出的細(xì)菌菌株產(chǎn)蛋白酶酶活(11.5 U/mL)活性比較，活性很高，添加到飼料中，對羊瘤胃吸收蛋白質(zhì)有很好的作用。

圖3 篩選菌株產(chǎn)蛋白酶的酶活Fig.3 Enzyme activity of protease produced from strains screened

2.2 瘤胃功能性細(xì)菌的抑菌特性

通過牛津杯法觀察篩選菌株對指示菌的抑菌效果，發(fā)現(xiàn)除菌株C2外，其余菌株對4種指示菌有不同程度的抑制作用。通過抑菌圈大小的比較，得出抑菌效果見表1。

表1 篩選菌株對指示菌的抑菌活性

注：“-”表示無抑菌活性

由表1可知，菌株C1、C3、C5、C6、C7、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16對副溶血弧菌指示菌有抑制活性，其中菌株C1、C3、C5、C7、C12、C13、C14、C15為低度敏感；菌株C6、C9、C10、C11、C16為中度敏感；菌株C3對產(chǎn)氣桿菌有抑制活性，且為中度敏感。菌株C1、C3、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16對大腸埃希菌有抑制活性，其中菌株C8、C9、C11、C14、C16為低度敏感；菌株C1、C3、C5、C6、C7、C10、C15為中度敏感；菌株C12、C13為高度敏感。菌株C1、C5、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16對藤黃八疊球菌有抑制活性，其中菌株C5為高度敏感；菌株C1為中度敏感；其余菌株均為低度敏感。

2.3 瘤胃功能性細(xì)菌的形態(tài)特征

將產(chǎn)酶特性優(yōu)越，抑菌活性良好的菌株C5、C9、C12、C13在掃描電子顯微鏡下觀察，結(jié)果見圖4。

圖4 瘤胃功能性細(xì)菌的形態(tài)特性Fig.4 Morphological character of functional bacteria from sheep rumen

由圖4可見，菌株C5為桿菌，菌體長度為3.15 μm，屬長桿菌，表面無莢膜;菌株C9為芽胞桿菌，屬端生芽胞，菌體長度為2.62 μm，表面有莢膜;菌株C12為芽胞桿菌，屬端生芽胞，其菌體長度為2.13 μm，屬短桿菌，表面無莢膜;菌株C13為桿菌，菌體長度為2.96 μm，屬短桿菌，表面無莢膜。以上4種菌均屬于兼性厭氧型細(xì)菌。

3 討 論

反芻動物瘤胃中分布許多益生菌，它們能產(chǎn)生纖維素酶、淀粉酶、蛋白酶等多種酶，參與機(jī)體對食物的消化吸收，同時通過生理代謝，對體內(nèi)有害細(xì)菌產(chǎn)生抑菌作用，促進(jìn)機(jī)體的免疫功能。本研究從羊瘤胃菌群中分離、純化得到16種菌株，測定其產(chǎn)纖維素酶、淀粉酶、蛋白酶的特性和抑制大腸埃希菌、副溶血弧菌、產(chǎn)氣桿菌和藤黃八疊球菌等指示菌的特性，并通過電子顯微鏡觀察其形態(tài)特征。結(jié)果表明，菌株C13的纖維素酶酶活最高，達(dá)3.59 U/mL；菌株C4、C5、C8產(chǎn)纖維素酶酶活均在3 U/mL以上；菌株C3、C12產(chǎn)纖維素酶酶活接近3 U/mL。菌株C5的淀粉酶酶活最高，達(dá)23.37 U/mL；菌株C12的淀粉酶酶活在20 U/mL以上，僅次于菌株C5；菌株C2、C6、C9的淀粉酶酶活均在10 U/mL以上。菌株C5產(chǎn)蛋白酶酶活最高，為46.82 U/mL；而菌株C6、C7、C11、C12、C13、C15產(chǎn)蛋白酶酶活也均在40 U/mL以上。抑菌活性方面，菌株C6、C9、C10、C11、C16對副溶血弧菌的抑制效果明顯，菌株C3對產(chǎn)氣桿菌有抑制作用，菌株C1、C3、C5、C6、C7、C10、C12、C13、C15對大腸埃希菌有抑制作用，其中菌株C12、C13的抑制作用最明顯。菌株C1、C5對藤黃八疊球菌均有很高的抑制作用。綜上所述，菌株C5產(chǎn)淀粉酶和蛋白酶的能力較強(qiáng)，且對副溶血弧菌、大腸埃希菌和藤黃八疊球菌有很明顯的抑制作用；菌株C9有產(chǎn)淀粉酶和蛋白酶的能力，且對副溶血弧菌和大腸埃希菌有明顯的抑制作用；菌株C12能產(chǎn)纖維素酶、淀粉酶和蛋白酶，其對大腸埃希菌的抑制作用很強(qiáng)；菌株C13能產(chǎn)纖維素酶、淀粉酶和蛋白酶，其對大腸埃希菌的抑制作用明顯。

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