產(chǎn)維素酶菌株SB-4的理化特性及產(chǎn)酶條件優(yōu)化

李昌珠，蔣麗娟，陳景震，張良波，易智彪，李培旺

纖維素是細胞壁中的重要成分，也是自然分布較廣、數(shù)量較多的多糖類生物質(zhì)資源［1-2］。纖維素在纖維素酶的作用下可降解為可溶性單糖或小分子糖等平臺化合物，被廣泛用于生物質(zhì)能源、食品、醫(yī)藥等行業(yè)［3-4］。纖維素規(guī)?；镛D(zhuǎn)化及應(yīng)用的首要條件是篩選出高產(chǎn)纖維素酶菌。在自然界中軟體動物、原生動物、微生物（真菌、細菌、放線菌等）都具有合成、分泌纖維素酶的能力［5］。目前，纖維素酶生產(chǎn)主要是通過真菌（木霉、曲霉、青霉等）和細菌（纖維黏菌、纖維桿菌和芽孢桿菌等）等進行生物發(fā)酵。但不同生物合成的纖維素酶種類和降解能力存在明顯不同［6］。真菌所產(chǎn)纖維素酶種類多為胞外酶，容易提取、純化，但大多數(shù)真菌孢子易傳播、感染，致病能力強。細菌所分泌的纖維素酶種類多，酶的協(xié)同效應(yīng)顯著，纖維素降解能力強，但分泌纖維素酶量少，且大多為胞內(nèi)酶。放線菌是抗菌素和纖維素酶的主要生產(chǎn)菌，產(chǎn)生的纖維素酶活力高，同時，放線菌為單細胞，結(jié)構(gòu)簡單，便于遺傳分析。放線菌發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶成為了國內(nèi)外的研究熱點。本文對在白蟻中分離獲得的高產(chǎn)纖維素酶放線菌的理化特性及發(fā)酵條件進行研究，不僅可以產(chǎn)纖維素酶放線菌種，豐富放線菌纖維素酶系，還可以為放線菌規(guī)?；瘧?yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種 菌種來源于油料能源植物高效轉(zhuǎn)化國家地方聯(lián)合工程實驗，為湖南省林業(yè)科學(xué)院從白蟻消化道分離獲得，命名為 SB-4。

1.1.2 培養(yǎng)基

（1）明膠培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨 0.5 g，葡萄糖 2 g，明膠 20 g；

（2）無機鹽纖維素水解培養(yǎng)基（g/L）：磷酸氫二鉀 0.5 g，氯化鈉 0.5 g，硝酸鉀 1 g，七水硫酸鎂 0.5 g，pH＝7.0～7.2；

（3）淀粉水解培養(yǎng)基：牛肉膏 5.0 g，蛋白胨 10.0 g，氯化鈉 5.0 g，可溶性淀粉 2.00 g，pH＝7.2～7.4；

（4）牛奶凝固培養(yǎng)基：牛奶 100 ml，碳酸鈣0.02 g，pH＝7.2～7.4；

（5）Tresner's 培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨 10 g，檸檬酸鐵 0.5 g，磷酸氫二鉀 1 g，瓊脂 15-20 g，pH＝7.2；

（6）黑色素產(chǎn)生培養(yǎng)基（g/L）：酪氨酸（L-Tyr）1 g，酵母膏 1 g，氯化鈉 8.5 g，瓊脂15～20 g，水 1 000 ml，pH＝7.2；

（7）基礎(chǔ)培養(yǎng)基：纖維素鈉 10 g，蛋白胨 1 g，硫酸銨 0.5 g，磷酸二氫鉀 1 g，氯化鉀0.5 g，七水硫酸鎂 0.2 g，二水硫酸鈣 0.1 g，pH＝7.5；

（8）發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：纖維素鈉 10 g，硫酸銨 0.5 g，磷酸二氫鉀 1 g，氯化鉀 0.5 g，七水硫酸鎂 0.2 g，二水硫酸鈣 0.1 g，pH＝7.5。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌落形態(tài)和生長特征觀測 將 2 μL 菌液涂布在 CMC2Na 培養(yǎng)基、葡萄糖-酵母膏培養(yǎng)基、高氏 1 號培養(yǎng)基、甘油天門冬素瓊脂培養(yǎng)基、無機鹽淀粉瓊脂培養(yǎng)基、酵母麥芽糖培養(yǎng)基（ISP-2）進行培養(yǎng)，待菌落形成后觀測單菌落形狀、大小、顏色和突起等特征。

1.2.2 菌種理化特性檢測

（1）革蘭氏染色：將菌涂片固定，按常規(guī)革蘭氏染色過程進行染色，觀測鑒定。

（2）明膠液化試驗：將 24 h 培養(yǎng)的幼齡菌穿刺接種滅菌后的明膠斜面培養(yǎng)基上，以兩支未接種的斜面培養(yǎng)基為空白對照，于 20 ℃ 條件下分別培養(yǎng) 2 d，7 d，10 d，14 d 和 30 d，在 20 ℃ 室溫下觀察菌落生長狀況和明膠是否液化。菌生長，明膠表面無凹痕仍保持為穩(wěn)定的凝塊，則為陰性；菌生長，在 20 ℃ 以下明膠凝塊部分或全部變成可流動的液體，則為明膠水解陽性。

（3）纖維素水解觀測：將長 5～7 cm，寬1～0.5 cm 的無菌濾紙條的 1/3 浸入接有本菌種無機鹽培養(yǎng)基中，以不接菌為對照，置于 28 ℃ 恒溫培養(yǎng) 10 d，觀察培養(yǎng)結(jié)果。

（4）淀粉水解觀測：將菌種接于淀粉培養(yǎng)基平板上，28 ℃ 培養(yǎng) 24 h，待菌落形成后滴少量碘液于平板中，觀察有無透明圈的產(chǎn)生。菌落周圍若出現(xiàn)無色透明圈，則說明淀粉已經(jīng)被水解。

（5）牛奶凝固與液化測定：將菌種接種在脫脂牛奶中，28 ℃ 恒溫培養(yǎng)，分別于第 3 d，第6 d，第 10 d，第 20 d，第 30 d 觀察培養(yǎng)基的變化，若牛奶凝塊，則為放線菌產(chǎn)生了凝乳酶，繼續(xù)培養(yǎng)，如凝固現(xiàn)象消失，溶液呈半透明或透明狀，則為菌種產(chǎn)生了蛋白酶，是蛋白水解為可溶性狀態(tài)，稱胨化。

（6）菌種產(chǎn)硫化氫測定：將菌種接種在tresner's 培養(yǎng)基上，28 ℃ 恒溫培養(yǎng) 10 d 左右，若出現(xiàn)黑褐色沉淀，則表示產(chǎn)生硫化氫，為陽性。

（7）菌株產(chǎn)黑色素觀測：將菌種接種于酪氨酸固體培養(yǎng)基上，28 ℃ 恒溫培養(yǎng)，于第 1 d，第2 d，第 4 d 觀察平板上黑色素產(chǎn)生狀況。

1.2.3 發(fā)酵條件優(yōu)化

（1）培養(yǎng)時間對菌體產(chǎn)酶的影響：從放線菌 SB-4 菌落上刮取孢子置于種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 d，按 15% 的接種量將接入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL 三角瓶中（裝液 200 mL），28 ℃，200 r/min條件下振蕩培養(yǎng)，每隔 24 h 取樣檢測發(fā)酵液酶活。

（2）通氣量對發(fā)酵液酶活的影響：分別將50、100、150 和 200 mL 液體培養(yǎng)基裝于 500 mL三角瓶進行摸擬不同的通氣量，其他培養(yǎng)條件不變，比較不同通氣量條件下菌體產(chǎn)酶的活性。

（3）發(fā)酵培養(yǎng)基中不同碳源對菌體產(chǎn)酶的影響：以甲基纖維素鈉、乳糖、葡萄糖、麥芽糖、糊精、甘露醇和甘油為單一碳源，裝液量為200 mL，其它培養(yǎng)發(fā)酵條件不變，培養(yǎng) 72 h 進行測發(fā)酵液酶活性。

（4）發(fā)酵培養(yǎng)基中不同氮源對菌體產(chǎn)酶的影響：以牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素、硝酸銨、光皮樹餅粕為單一氮源，裝液量為 200 mL，其它培養(yǎng)發(fā)酵條件不變，培養(yǎng) 72 h 進行測發(fā)酵液酶活性。

1.2.4 纖維素酶活測定 內(nèi)切葡聚糖酶（CMC）活力測定采用 CMC 糖化法測定［7］。濾紙酶（FPA）則定采用濾紙?zhí)腔ǎ?］。β-葡萄糖苷酶（Cx）活力測定采用分光光度法［9］。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 采用 Microsoft Excel 2010、SPSS 18.0 統(tǒng)計軟件對試驗數(shù)據(jù)進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株 SB-4 的菌絲、菌落形態(tài)及生長特性

菌株 SB-4 在不同的培養(yǎng)基中形成的菌落形態(tài)及生長特性存在明顯的區(qū)別，結(jié)果見表 1。菌株 SB-4 在 CMC2Na 培養(yǎng)基上菌落生長良好（見圖 1），單菌落，同心環(huán)，最初為白色，4 d 后逐漸變成淺灰色，氣生菌絲分枝，孢子排列成節(jié)（見圖 2），SB-4 菌株在無機鹽淀粉瓊脂培養(yǎng)基上基本不生長。根據(jù)閻遜初編著《放線菌的分類和鑒定》［10］，初步斷定為放線菌節(jié)桿菌屬。

圖 1 SB-4 在 CMC2Na 培養(yǎng)基中菌落特性Fig.1Colony characteristic of SB-4 strain on CMC2Na medium

圖 2 菌絲及孢子顯微形態(tài)結(jié)構(gòu)Fig.2 Microscopic structure of mycelium and spore

2.2 菌株 SB-4 生理生化特性

表 2 所示為菌株 SB-4 的生理生化特性的鑒定結(jié)果，其中革蘭氏染色、纖維素水解試驗、淀粉水解試驗、牛奶凝固與液化試驗、產(chǎn)硫化氫測定試驗、黑色素產(chǎn)生試驗均呈陽性，而明膠液化試驗呈陰性。

表1 SB－4 在不同培養(yǎng)基上生長的菌落特征Tab.1 Colony characteristics of strain SB-4on different medium

表2 SB－4 的生理生化試驗結(jié)果Tab.2 Physiological and biochemical properties of strain SB-4

2.3 SB-4 發(fā)酵條件優(yōu)化

2.3.1 不同發(fā)酵時間對 SB-4 酶活的影響 不同發(fā)酵時間對纖維素酶 CMC、FPA、Cx 酶活性的影響見圖 3。由圖可知，三種纖維素酶活性在發(fā)酵的第 12～24 h 出現(xiàn)快速增加，第 24～72 h 則進入平緩增加期，到第 72 小時達到最大值，分別為隨后出現(xiàn)緩慢下降。這與菌體的生長曲線和酶的產(chǎn)量具有一定的相關(guān)性?？紤]能耗和酶活性之間的關(guān)系，該菌株最佳的培養(yǎng)時間是 72 h，此時對纖維素酶 CMC、FPA、Cx 酶活性分別為 39.94 U/mL、28.13 U/mL 和 21.89 U/mL.

圖3 培養(yǎng)時間對菌株SB-4酶活的影響Fig.3Effect of culture time on enzyme activity of strain SB-4

2.3.2 通氣量對 SB-4 酶活的影響 通過不同裝液量模擬通氣量，不同通氣量對 SB-4 酶活性的影響見圖 4。由圖可知，通氣量對纖維素酶 CMC、FPA、Cx 酶活性的影響趨勢一致，但均不是顯著，也說明在 50～250 m 裝液量對菌體產(chǎn)酶影響不大。纖維素酶 CMC、FPA、Cx 酶活性在裝液量為 200 ml 時為最高，分別為 39.94 U/mL、28.13 U/mL 和 21.89 U/mL。綜合考慮，最佳的通氣量為300 mL，即 500 ml 三角瓶中裝入 200 mL 發(fā)酵液。

圖4 裝液量對菌株SB-4酶活的影響Fig.4Effect of medium volume on enzyme activity of strain SB-4

2.3.3 不同氮源對 SB-4 酶活性的影響 以牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素、硝酸銨、光皮樹餅粕為單一氮源，不同氮源培養(yǎng)對 SB-4 酶活性的影響見圖 5。由圖可知，有機氮源對 SB-4 纖維素酶 CMC、FPA、Cx 酶活性比無機氮源高，其中以酵母膏為單一氮源的酶活性最高，光皮樹餅粕次之，尿素最小。酵母膏為最佳氮源，以其為單一氮源發(fā)酵時纖維素酶 CMC、FPA 和 Cx 酶活性分別為 47.09 U/ml、41.81 U/mL 和 28.62 U/mL。

2.3.4 不同碳源對 SB-4 酶活性的影響 甲基纖維素鈉、乳糖、葡萄糖、麥芽糖、糊精、甘露醇和甘油為單一碳源，不同碳源培養(yǎng)對 SB-4 酶活性的影響見圖 6。由圖可知，不同碳源對 SB-4 纖維素酶 CMC、FPA、Cx 酶活性影響顯著，其中以羧甲基纖維素鈉為碳源的酶活力最高，其次是乳糖、葡萄糖、麥芽糖、糊精、甘露醇，甘油最小。羧甲基纖維素鈉為最佳碳源，以其為單一碳源發(fā)酵時，纖維素酶 CMC、FPA 和 Cx 酶活性分別為 48.68 U/ml、39.69 U/mL 和 39.42 U/mL。

圖5 氮源對菌株SB-4酶活性的影響Fig.5 Effect of nitrogen sources on enzyme activity of strain SB-4

圖6 碳源對菌株SB-4酶活性的影響Fig.6 Effect of carbon sources on enzyme activity of strain SB-4

3 結(jié)論與討論

高等白蟻生境多樣，飲食結(jié)構(gòu)豐富，以富含木質(zhì)素、纖維素的木材、枯草等為食源［11-12］。白蟻的腸道內(nèi)共生有大量的細菌、真菌、放線菌等微生物［13］，可篩選出多種高產(chǎn)纖維素酶菌株。本試驗利用羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)法、革蘭氏染色法、牛奶凝固與液化法、產(chǎn)硫化氫生產(chǎn)、黑色素產(chǎn)生和纖維素酶活性測定法對產(chǎn)纖維素酶 SB-4 菌株進行鑒定，結(jié)合菌落形態(tài)觀察和菌絲及孢子顯微鏡觀察,初步斷定為放線菌節(jié)桿菌屬。

微生物發(fā)酵是個非常復(fù)雜的過程，其生產(chǎn)工藝受眾多因素影響，如培養(yǎng)基、培養(yǎng)時間、通氣量、氮源、碳源等［13］。培養(yǎng)條件的優(yōu)劣直接影響微生物發(fā)酵效率及產(chǎn)酶能力。因而，微生物發(fā)酵條件優(yōu)化極其重要。本試驗對篩選出的放線菌 SB-4 在發(fā)酵時間、通氣量、氮源和碳源等產(chǎn)酶條件上進行優(yōu)化。最優(yōu)條件是以酵母膏為氮源，以羧甲基纖維素鈉碳源，通氣量為 300 mL，即在 500 ml 三角瓶中裝入 200 mL 發(fā)酵液，發(fā)酵 72 h，SB-4 菌株的纖維素酶 CMC、FPA 和 Cx 酶活性分別為 47.09 U/ml、41.81 U/mL 和 28.62 U/mL。

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