一株粗糙脈胞菌的鑒定及產(chǎn)纖維素酶發(fā)酵工藝優(yōu)化

張玲秀，白建華，郝瑞林，董社琴

（忻州師范學(xué)院生物系，山西忻州034000）

秸稈纖維素可再生、易獲得，其相對(duì)于木質(zhì)材料木質(zhì)素含量低，對(duì)其工業(yè)利用中酶需求量和花費(fèi)也較低，所以玉米秸桿作為一種優(yōu)質(zhì)生物能源材料，更具有商業(yè)利用價(jià)值（Banerjee等，2008）。

通過(guò)微生物產(chǎn)酶降解秸桿纖維素具有條件溫和，無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn)，因此分離和篩選出針對(duì)不同行業(yè)的高效纖維素分解菌群，有望解決纖維素酶產(chǎn)量和活性不高，而成本偏高的問(wèn)題 （張傳富等，2007）。 粗糙脈孢菌（Neurospora crassa）是木質(zhì)纖維素天然降解真菌，具有良好的遺傳操作手段和功能基因組工具，在纖維素降解、糖轉(zhuǎn)運(yùn)及全糖利用、纖維素酶表達(dá)分泌的分子基礎(chǔ)等方面取得了顯著進(jìn)展（Jonathan 等，2010；Tian 等，2009）。 李建波等（2004）對(duì)粗糙脈孢菌乙醇發(fā)酵、黑色素分泌、木糖發(fā)酵等做了較為系統(tǒng)的研究。馮炘等（2005）通過(guò)優(yōu)化設(shè)計(jì)確定了Neurospora crassa 1602菌株搖瓶發(fā)酵的最佳產(chǎn)酶單因素產(chǎn)酶條件。顧芮萌等（2012）以粗糙脈孢菌基因組測(cè)序菌株fgsc2489為對(duì)象，利用相應(yīng)面法，對(duì)粗糙脈孢菌纖維素酶液體發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化。

目前，對(duì)粗糙脈胞菌產(chǎn)纖維素酶液體發(fā)酵培養(yǎng)條件工藝研究鮮有報(bào)道。本文以從忻州農(nóng)田玉米秸桿中篩選的一株粗糙脈孢菌為對(duì)象，以玉米秸桿粉為碳源，首先進(jìn)行單因素優(yōu)化，進(jìn)一步利用響應(yīng)面法，對(duì)粗糙脈孢菌纖維素酶液體發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化。旨在提高產(chǎn)纖維素酶量，為其進(jìn)一步開發(fā)利用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA），自然pH。產(chǎn)纖維素酶培養(yǎng)基/L：玉米秸桿粉2%， 蛋白胨 5.0 g，NaCl 0.5 g，KH2PO40.1 g，MgSO4·7H2O 0.5 g， 酵母粉 1 g，pH 自然。1.2 方法

1.2.1 菌種的鑒定 菌種的形態(tài)學(xué)分類鑒定參見(jiàn)魏景超（1979）方法。

真菌18SrDNA擴(kuò)增鑒定：采用CTAB法提取總 DNA，PCR 擴(kuò)增引物為 ITS1：5'TCCG TAGG TGAA CCTG CGG3'和 ITS4：5'TCCT CCGC TTAT TGATATGC3'。PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性4min，然后進(jìn)入循環(huán)，94℃變性1 min，55℃退火40 s，72℃延伸 90 s，共 35個(gè)循環(huán)，最后 72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離，Image Lab 3.0軟件分析。

1.2.2 CMC-Na酶活力測(cè)定 纖維素酶活力的定義（IU/mL）：指 1 min 催化底物生成 1 μmol葡萄糖所需要的酶量。

Y=（D·n·1000）/T·V·M；

式中：D為生成的葡萄糖含量；由標(biāo)準(zhǔn)曲線得知，n為稀釋倍數(shù)；T為反應(yīng)時(shí)間，30 min；V為酶液體積，1 mL；M為葡萄糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，180。

取兩支試管（試驗(yàn)組和對(duì)照組），各加入2 mL 1%CMC-Na溶液，試驗(yàn)組加 0.5 mL稀釋酶液，空白對(duì)照不加，混勻后置于50℃水浴，反應(yīng)30 min，兩試管都加入DNS試劑3 mL，空白管加入100℃煮沸10 min后失活的酶液0.5 mL，搖勻后將兩管放入沸水浴加熱10 min，取出迅速冷卻到室溫，空白管調(diào)零，在540 nm下測(cè)試驗(yàn)組吸光值，通過(guò)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算還原性糖含量。

1.2.3 單因素及響應(yīng)面法優(yōu)化設(shè)計(jì) 單因素優(yōu)化選取4個(gè)因素:培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度、轉(zhuǎn)速、初始pH，以CMC-Na酶活力為指標(biāo)，得到各因素最適水平，然后根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)響應(yīng)曲面分析試驗(yàn)，其因素水平編碼見(jiàn)表1。

表1 因素水平編碼

2 結(jié)果

2.1 rDNA-ITS序列測(cè)序與比對(duì)結(jié)果分析 基因擴(kuò)增產(chǎn)物純化后由生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，菌種與從GENBANK獲取的相似序列經(jīng)DNAMAN軟件進(jìn)行比對(duì)分析并構(gòu)建N-J系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖1。

圖1 粗糙脈孢菌QF的rDNA-ITS系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶量的影響 將活化菌種接入培養(yǎng)瓶中，28℃連續(xù)培養(yǎng)7 d，每隔24 h檢測(cè)一次酶產(chǎn)量，繪制產(chǎn)酶曲線。結(jié)果見(jiàn)圖2，第5天產(chǎn)酶量最多，因而后續(xù)研究選擇產(chǎn)酶最高的第5天進(jìn)行分析。

圖2 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響

2.3 培養(yǎng)溫度對(duì)產(chǎn)酶量的影響 分別選取不同溫度:22、25、28、31、34 ℃，連續(xù)培養(yǎng) 5 d 后，測(cè)定其酶活，結(jié)果見(jiàn)圖3，發(fā)酵溫度與產(chǎn)酶量有一定的關(guān)系，溫度過(guò)高或者過(guò)低都會(huì)影響酶的合成和分泌，其中，28℃條件下，產(chǎn)酶最高，為7.4 IU/mL。

圖3 培養(yǎng)溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響

2.4 搖瓶轉(zhuǎn)速對(duì)產(chǎn)酶量的影響 在不同搖床轉(zhuǎn)速下（50、100、150、200、250 r/min）培養(yǎng) 5 d，測(cè)定其發(fā)酵液酶活，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 搖瓶轉(zhuǎn)速對(duì)產(chǎn)酶的影響

2.5 初始pH對(duì)產(chǎn)酶量的影響 不同初始pH培養(yǎng)基（1、3、5、7、9）對(duì)產(chǎn)酶量的影響如圖 5 所示。

圖5 初始pH對(duì)產(chǎn)酶的影響

2.6 響應(yīng)曲面試驗(yàn)結(jié)果

2.6.1 Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果 以初始pH（X1）、轉(zhuǎn)速（X2）、溫度（X3）為自變量，以產(chǎn)纖維素酶量為響應(yīng)指標(biāo)，采用 Box-Behnken方法設(shè)計(jì)響應(yīng)面分析試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.6.2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)結(jié)果 根據(jù)表2的試驗(yàn)結(jié)果，利用Design Expert v8.0.5.b軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，所得主要分析結(jié)果見(jiàn)表3。

二次模型中回歸系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)表明：因素A對(duì)產(chǎn)酶量影響效果的線性效應(yīng)顯著，因素B和C效應(yīng)不顯著；因素A2、B2、C2對(duì)結(jié)果的曲面效應(yīng)顯著，因素交互影響均不顯著。對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多次擬合回歸，以纖維素酶量（Y）為因變量，初始pH（A）、轉(zhuǎn)速（B）、溫度（C）為自變量建立回歸方程模型為：

表3 回歸與方差分析結(jié)果

Y=+12.31+1.29A+0.88B+0.72C+0.41AB-0.068AC-0.022BC-2.23A2-3.47B2-1.89C2。

另外，由表3可知，試驗(yàn)因素對(duì)產(chǎn)酶量影響顯著程度由大到小依次為初始pH＞轉(zhuǎn)速＞溫度；模型的回歸F值為11.91，P=0.0018（P＜0.05為模型顯著），表明該模型極顯著；多元相關(guān)系數(shù)R2=0.9387，調(diào)整R2=0.9399，表明模型對(duì)試驗(yàn)實(shí)際情況擬合較好，失擬項(xiàng)差異不顯著 （P=0.2277＞0.05），表示該方程試驗(yàn)擬合效果較好。

2.6.3 響應(yīng)面圖及等高線圖 響應(yīng)面和等高線結(jié)果見(jiàn)圖6～8。在響應(yīng)曲面圖中，單因素影響效果與曲面陡峭相關(guān)，曲面越陡峭，影響越顯著。等高線圖與響應(yīng)面圖相對(duì)應(yīng)，響應(yīng)值越大曲線越接近中心。各因素交互作用與等高線形狀相關(guān)，圓形則為不顯著，橢圓為顯著。

通過(guò) Design Expert（v8.0.5.b）軟件分析，粗糙脈孢菌產(chǎn)酶量的最佳培養(yǎng)條件為初始pH 7、轉(zhuǎn)速159.24 r/min、培養(yǎng)溫度27.9℃，此條件下菌體生物量的理論值為17.67 IU/mL。在該條件下進(jìn)行3次試驗(yàn)驗(yàn)證，產(chǎn)酶量平均值為17.1 IU/mL，與預(yù)測(cè)值的誤差僅為3.23%，表明該模型可靠性高，應(yīng)用響應(yīng)曲面法優(yōu)化粗糙脈孢菌產(chǎn)纖維素酶的培養(yǎng)條件是可行的。

圖6 初始pH與轉(zhuǎn)速及其交互作用對(duì)產(chǎn)酶量影響的響應(yīng)面和等高線圖

圖7 轉(zhuǎn)速與溫度及其交互作用對(duì)產(chǎn)酶量影響的響應(yīng)面和等高線圖

圖8 初始pH與溫度及其交互作用對(duì)產(chǎn)酶量影響的響應(yīng)面和等高線圖

3 討論

農(nóng)業(yè)廢棄物主要包括農(nóng)作物秸稈、畜禽糞便等，其主要組成成分是纖維素類物質(zhì)。化工領(lǐng)域利用纖維素主要用高溫、高壓、強(qiáng)酸等方法處理，不僅成本高，而且污染環(huán)境（楊林麗等，2013）。

纖維素酶降解方法的優(yōu)點(diǎn)是能源消耗低，是專一性很強(qiáng)的催化劑，但酶分子體積龐大，很難越過(guò)半纖維素和木質(zhì)素的障礙，與纖維素緊密結(jié)合，所以進(jìn)行該方法的反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)，且需在加熱過(guò)程中進(jìn)行振蕩加熱，使反應(yīng)充分，一般要培養(yǎng)5～7 d，在培養(yǎng)菌絲的過(guò)程中容易有雜菌生長(zhǎng)，需進(jìn)行雜菌的處理。另外應(yīng)用纖維素酶法處理秸稈纖維素條件溫和，但酶活力一直達(dá)不到應(yīng)用于實(shí)踐的水平，而且價(jià)格昂貴。所以開發(fā)高產(chǎn)纖維素酶的菌種，利用酶固定化催化法是可行的辦法（Rizzatti等，2001）。

響應(yīng)面法是一項(xiàng)綜合數(shù)學(xué)和統(tǒng)計(jì)學(xué)方法的優(yōu)化技術(shù)。此方法可以對(duì)影響相關(guān)響應(yīng)值的多個(gè)因素進(jìn)行建模和分析，評(píng)估多個(gè)因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系，得到最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基條件（Jatinder等，2006）。

響應(yīng)面分析法在粗糙脈孢菌產(chǎn)纖維素酶培養(yǎng)條件的優(yōu)化中取得了較為良好的效果，利用粗糙脈孢菌發(fā)酵產(chǎn)酶的研究還處在初期階段，要實(shí)現(xiàn)其產(chǎn)酶潛力，還需要大量的研究，特別是針對(duì)深層液體發(fā)酵條件的菌株遺傳改造工作和適合粗糙脈孢菌液體發(fā)酵條件優(yōu)化值得深入研究（顧芮萌等，2012）。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)以忻州地區(qū)腐敗玉米秸桿、牛羊等食草動(dòng)物糞便為原料，從中篩選出一株降解纖維素菌種，并確定其為粗糙脈孢菌（Neurosporacrassa）。通過(guò)對(duì)其液體發(fā)酵產(chǎn)纖維酶工藝進(jìn)行優(yōu)化，在最佳培養(yǎng)條件初始pH 7、轉(zhuǎn)速159.24 r/min、培養(yǎng)溫度27.9℃下，經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證，產(chǎn)酶量為17.1 IU/mL，提高了39.1%。

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