基于多來源數(shù)據(jù)分析河南省刺魚目新紀錄種
——中華多刺魚

周傳江， 顧錢洪， 孟曉林， 李斌順， 趙文武， 龐顯炳， 張建新， 宋東鎣， 聶國興*

(1. 河南省水產(chǎn)動物養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，河南師范大學水產(chǎn)學院，河南新鄉(xiāng)453007；2.林州市水產(chǎn)站，河南林州456550； 3. 安陽市水產(chǎn)科學研究所，河南安陽455000)

中華多刺魚Pungitiussinensis隸屬于刺魚目Gasterosteiformes刺魚科Gasterosteidae多刺魚屬Pungitius。關(guān)于該屬及近緣種的研究涉及到種群、生態(tài)學、系統(tǒng)發(fā)育、進化生物學等方面(Chae，1988；Chae & Yang，1988，1993；Takahashi & Goto，2001；Watanabeetal.，2003；Koizumietal.，2007；卞紹雷等，2008；Hubertetal.，2008；Kietal.，2008；Aldenhovenetal.，2010；Shikanoetal.，2010；Teacheretal.，2011；Hwangetal.，2012；McCuskeretal.，2013；Geigeretal.，2014；Denysetal.，2015；Rezansoffetal.，2015；Thalingeretal.，2016)。據(jù)資料記載，我國有4種刺魚分布，即刺魚屬Gastersteus的三刺魚Gastersteusaculeatus(鄭葆珊等，1980；成慶泰，周才武，1997)和多刺魚屬的中華多刺魚P.sinensis、刺魚P.pungitius(即八棘多刺魚；任慕蓮等，1981)、多刺魚P.pungitiussinensis(尼科爾斯基，1960)。中華多刺魚在我國北方分布廣泛，如黑龍江(尼科爾斯基，1960；任慕蓮，1981；張覺民，1995)、圖們江(鄭葆珊等，1980)、北京(王鴻媛，1984)、遼寧(劉嬋馨，秦克靜，1987)、天津(天津市水產(chǎn)學會，1990；李明德，2011)、河北(李明德，楊竹舫，1992；王所安等，2000)、山東(成慶泰，周才武，1997)?！吨袊~類系統(tǒng)檢索》(成慶泰，鄭葆珊，1987)中記錄中華多刺魚在黑龍江、松花江、圖們江、遼河、內(nèi)蒙古、河北及長江流域有分布，但《長江魚類》(湖北省水生生物研究所魚類研究室，1976)中并沒有記錄該種，所以卞紹雷等(2008)認為北京及其周邊地區(qū)可能為中華多刺魚在亞洲大陸的最南分布點。2015年10月，河南省魚類資源調(diào)查隊在河南省林州市進行魚類資源普查時，采集到30尾刺魚目魚類，綜合采用形態(tài)學和分子系統(tǒng)學的方法確定其為中華多刺魚，本種系河南省新紀錄種，標本保存于河南師范大學水產(chǎn)學院魚類標本室。本文初步分析了該魚的主要鑒定特征、在河南省的分布區(qū)域、可能來源、生存環(huán)境等。

1 材料與方法

1.1 材料

30尾實驗魚均采自河南省林州市五龍鎮(zhèn)河頭村河頭大橋(113°56′27.89″E，35°50′14.59″N)，地籠誘捕獲得，13尾100%乙醇和17尾10%甲醛溶液整體固定，帶回實驗室進行測量和后續(xù)實驗。

1.2 形態(tài)測量

對17尾甲醛溶液固定標本用數(shù)顯游標卡尺(單位：mm)測量全長、體長、頭長、眼徑、吻長、眼后頭長、吻寬、體高、尾柄長、尾柄高、吻至背鰭長、第一背鰭長、第二背鰭長、背鰭高、臀鰭基長、臀鰭高、胸鰭基長、腹鰭基長，并計數(shù)背鰭棘數(shù)目、臀鰭和胸鰭鰭條數(shù)目及棘數(shù)。

1.3 分子生物學及分子系統(tǒng)學方法鑒定

1.3.1基因組DNA提取取適量經(jīng)酒精固定的標本背部肌肉組織置于1.5 mL離心管中，55 ℃烘干4 h后采用酚-氯仿提取法提取基因組DNA(薩姆布魯克，拉塞爾，2008)。

1.3.2PCR擴增獲得目的基因PCR擴增線粒體COⅠ基因的引物對為HCO：5’-AAACYTCWGGGTGVCCAAAGAAYC-3’，LCO：5’-TACTAAYCACAAAGATATTGGCAC-3’(Folmeretal.，1994)。30 μL PCR反應(yīng)體系包含：15 μL mix，上、下游引物各1 μL，基因組DNA 1 μL，滅菌水12 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物分別用上、下游引物測序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

從測序公司返回的測序結(jié)果為峰圖文件，采用DNASTAR的Seqman組裝為一個contig，通過NCBI網(wǎng)站進行BLAST分析(https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，確認為目的基因COⅠ，同時從NCBI下載刺魚目及其近緣種的COⅠ基因序列共71條(表1)，用MEGA 7.0(Kumaretal.，2016)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹和計算遺傳距離。系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建采用NJ原理Kimura雙參法，1 000個重復(fù)抽樣，其他參數(shù)為默認設(shè)置。遺傳距離估算依據(jù)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹將同種的分為同一個群，之后分別計算群內(nèi)和群間的遺傳距離，進而對這些序列及物種之間的關(guān)系進行評價。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學分析結(jié)果

形態(tài)鑒定30尾，均符合中華多刺魚的主要鑒別特征：眼較大，體長，呈側(cè)扁形，尾柄極細，有明顯側(cè)棱。側(cè)線上有31～33個骨板，尾截形或微凹入(圖版Ⅰ：1)，具2個背鰭，第一背鰭為游離的棘，具有交錯排列的8～9個棘(圖版Ⅰ：2)，第二背鰭和臀鰭相對，8～10個鰭條，臀鰭具1棘8～10個鰭條，胸鰭為8～9個鰭條，腹鰭為1棘1～2個鰭條(圖版Ⅰ：3)。形態(tài)測量顯示(n=17)：全長49.22±3.90，體長41.79±5.57，頭長11.85±1.35，眼徑3.57±0.47，吻長3.02±0.70，眼后頭長5.83±0.88，尾柄長7.18±0.80，尾柄高1.34±0.16，吻至背鰭長13.28±0.99，第一背鰭長13.67±1.64，第二背鰭長10.50±1.31，背鰭高4.33±0.87，臀鰭基長10.47±1.16，臀鰭高4.75±0.57，胸鰭基長2.48±0.30，腹鰭基長6.93±0.72。體長為體高的4.4～6.9倍，為頭長的3.0～4.5倍。頭長為吻長的2.4～6.2倍，為眼徑的2.5～4.0倍，為尾柄長的1.2～2.0倍，為尾柄高的7.0～12.0倍，尾柄長為尾柄高的4.3～7.3倍。

圖版Ⅰ 中華多刺魚的主要鑒別特征及生境Plate Ⅰ The main diagnostic characteristics and habitat of Pungitius sinensis

1.中華多刺魚整體； 2. 第一背鰭的棘(白色箭頭所指)和第二背鰭(黃色箭頭所指)； 3. 腹鰭及臀鰭的棘(白色箭頭所指)和骨板(黃色箭頭所指)； 4. 中華多刺魚生活水體環(huán)境； 比例尺=1 cm

1. Whole body ofP.sinensis； 2. Spines of first dorsal fin (white arrow) and the second dorsal fin (yellow arrow)； 3. Spines of ventral fin and anal fin (white arrow) and bone plate (yellow arrow)； 4. Living water environment ofP.sinensis； scale bar=1 cm

2.2 分子生物學及分子系統(tǒng)學結(jié)果

PCR擴增共獲得中華多刺魚線粒體COⅠ基因序列10條，與NCBI下載的刺魚目及近緣種的61條COⅠ基因序列一起比對后發(fā)現(xiàn)：589 bp序列中保守位點448個，簡約信息位點133個，T、C、A、G含量分別為28.4%、30.2%、23.6%、17.8%，A+T含量高于G+C含量。71條序列構(gòu)建的NJ樹顯示(圖1)，外群聚為單獨的一支，多刺魚屬構(gòu)成支持率為100%的單系類群，但各支情況有所不同，圖們江多刺魚P.tymensis位于多刺魚屬的基部。光身多刺魚P.laevis、本研究的中華多刺魚、沼澤多刺魚P.hellenicus、平腹多刺魚P.platygaster的所有個體均聚在一起構(gòu)成高支持率的單系。而廣布種八棘多刺魚則分為多個分支，可能因其分布范圍較廣，不同區(qū)域的種群已經(jīng)發(fā)生了分化。

同種魚的群內(nèi)遺傳距離為0～0.006(如八棘多刺魚為0.006、僅有一個個體的圖們江多刺魚無法計算、光身多刺魚為0.002、沼澤多刺魚為0、平腹多刺魚為0.001、中華多刺魚為0)，可以判斷依據(jù)系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果進行群的劃分是可靠的，同種個體均聚在一支且遺傳距離小于0.02。八棘多刺魚和光身多刺魚的遺傳距離比較近(0.008<0.02)，且在系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果中，光身多刺魚也是嵌套在八棘多刺魚中，初步推測八棘多刺魚和光身多刺魚可能為同一物種。其他不同物種之間遺傳距離均大于0.02，初步推斷為不同物種(表2)。

3 討論

3.1 中華多刺魚物種的確定

在中國分布的刺魚類有以下4種，一種為分布于圖們江(鄭葆珊等，1980)和山東(成慶泰，周才武，1997)的三刺魚，另一種為刺魚(任慕蓮等，1981，即八棘多刺魚)，還有一種是多刺魚(尼科爾斯基，1960)。尼科爾斯基在《黑龍江流域魚類》提到除了三刺魚外，同時也提到了其他多個地方志均對中華多刺魚有記載(王鴻媛，1984；劉嬋馨，秦克靜，1987；天津水產(chǎn)學會，1990；李明德，楊竹舫，1992；成慶泰，周才武，1997；王所安等，2000；李明德，2011)。這些文獻中記載的中華多刺魚重要形態(tài)鑒定特征基本一致，但對比記錄數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)形態(tài)長度及長度指標比例存在較大偏差，同時本文獲得的數(shù)據(jù)也和已有報道有一定出入，可能是采集地不同及測量誤差造成的，如本文中頭長為尾柄長的1.2～2.0倍，為尾柄高的7.0～12.0倍，而《圖們江魚類志》(鄭葆珊等，1980)記載的中華多刺魚相應(yīng)指標為4.6～4.8倍和1.7～1.9倍。結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育研究，本研究樣本單獨聚為一支，群內(nèi)遺傳距離為0，與其他已知的多刺魚屬魚類的遺傳距離均超過了同種的遺傳距離，可以判定為中華多刺魚。

圖1 基于線粒體COⅠ基因的多刺魚屬系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系Fig.1 Phylogenetic relationship of the genus Pungitius inferred from mitochondrial COⅠ gene

物種名稱NCBI登錄號或樣品編號數(shù)據(jù)來源內(nèi)群中華多刺魚PungitiussinensisHTU402427～HTU402431、HTU402436～HTU402440本研究沼澤多刺魚P.hellenicusKJ554130、KJ554255、KJ554514Geigeretal.,2014平腹多刺魚P.platygasterKJ554195、KJ554199、KJ554378Geigeretal.,2014光身多刺魚P.laevisKJ554327、KJ554413Geigeretal.,2014圖們江多刺魚P.tymensisKM019403Geigeretal.,2014八棘多刺魚P.pungitiusEU524319～EU524321、EU525105～EU525112Hubertetal.,2008八棘多刺魚P.pungitiusKJ128593、KJ128594Bergstenetal.,unpublished八棘多刺魚P.pungitiusKT630717、KT630718Rodgers&Mock,unpublished八棘多刺魚P.pungitiusKR477087～KR477089、KR477243～KR477245Thalingeretal.,2016八棘多刺魚P.pungitiusHQ712742Mecklenburgetal.,2011八棘多刺魚P.pungitiusKC015860、KC015861McCuskeretal.,2013八棘多刺魚P.pungitiusKM287043～KM287048Knebelsbergeretal.,2015八棘多刺魚P.pungitiusKR862862Denysetal.,2015外群Gasterosteussp.KJ553578、KJ553600、KJ553622、KJ553623Geigeretal.,2014二棘刺魚G.wheatlandiEU524640～EU524642Hubertetal.,2008三刺魚G.aculeatusKP823178、KP823179Rezansoffetal.,2015三刺魚G.aculeatusKR862765～KR862768Denysetal.,2015裸尾刺魚G.gymnurusKR862829～KR862832Denysetal.,2015冰島刺魚G.islandicusKR862833～KR862836Denysetal.,2015

表2 不同群(物種)之間遺傳距離計算結(jié)果Table 2 The genetic distance between different groups (species) of genus Pungitius

3.2 中華多刺魚的分布范圍及生境情況

卞紹雷等(2008)認為北京是中華多刺魚分布的最南邊界，此次在河南林州的發(fā)現(xiàn)進一步擴大了該魚的分布范圍?！吨袊~類系統(tǒng)檢索》(成慶泰，鄭葆珊，1987)提到中華多刺魚在長江流域也有分布，但《長江魚類》(湖北省水生生物研究所魚類研究室，1976)并沒有該魚的記載，因此該魚在長江流域的分布情況需進一步確認。本文采集點屬淇河(衛(wèi)河水系)，該樣點水質(zhì)狀況良好，水體清澈，流水處有細沙質(zhì)地質(zhì)，而靜水處有20 cm厚淤泥，水體中有大量水草分布，該魚在水草較豐富靠近岸邊水流較緩處采集較多，這與其有筑巢行為有關(guān)。

3.3 林州市中華多刺魚的來源及保護

在對河南省魚類資源調(diào)查中，僅在林州一個采樣點發(fā)現(xiàn)了中華多刺魚，且種群數(shù)量有限，這和該處生境水質(zhì)良好、有大量水草，適宜有特殊產(chǎn)卵習性的中華多刺魚繁殖有關(guān)。同時作者也訪問了附近居民及林州市漁政管理人員，他們均反映之前沒有發(fā)現(xiàn)此種魚類，也沒有該種魚的引入記錄，這也許與該種魚個體較小，沒有太大經(jīng)濟價值有關(guān)，因此推測可能為自然分布。此后調(diào)查隊數(shù)次在此地開展復(fù)查，均獲得了數(shù)量不等的樣本，說明中華多刺魚在該地仍保持一定數(shù)量。關(guān)于該種魚在林州的分布范圍，在調(diào)查隊擴大采集范圍及安陽市水產(chǎn)科學研究所開展全市其他區(qū)縣調(diào)查中，均沒有采集到此種魚類，因此不排除人為帶入的可能性。但該種魚類在該樣點已經(jīng)形成相對穩(wěn)定的種群，且多次采樣均獲得該魚，說明其可以適應(yīng)該處的水文條件。同時調(diào)查隊在該樣點采集獲得了包括中華多刺魚在內(nèi)的17種魚類，該樣點魚類種類多樣性較高。中華多刺魚為北京市二級保護動物(http：//www.bjny.gov.cn/nyj/231595/232732/605601/490633/index.html)，同時，特殊的體型及繁殖習性讓該魚成為研究魚類進化生物學、繁殖生物學、行為生態(tài)學的優(yōu)良模型。

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