斯庫臺渦蟲屬一新種(單腸目，斯庫臺科)及其分子系統(tǒng)學分析

陳龍， 馮偉濤， 林逸濤， 盧素雅， 汪安泰

(深圳大學生命與海洋科學學院，深圳市海洋生物資源與生態(tài)環(huán)境重點實驗室，廣東深圳518060)

首例切頭類渦蟲于1846年在圣地亞哥Santiago被發(fā)現(xiàn)，當時將其歸屬于環(huán)節(jié)動物門水蛭類(Moquin-Tandon，1846)。之后，因其體表光滑、具吸盤，組織學結構具有扁形動物特征，建立了切頭綱Temnocephalida，分類地位介于 “渦蟲綱Turbellaria”與吸蟲綱Trematoda之間；經過對其形態(tài)、分類、分布等的研究，又將其歸為“渦蟲綱切頭目Temnocephalida”(唐仲璋，1959)。隨著分子系統(tǒng)學技術的發(fā)展與研究的深入，原“渦蟲綱”內容發(fā)生很大變化：無腸目Acoela被移出扁形動物門Platyhelminthes，其余物種被劃分為鏈蟲綱Catenulida與被桿體綱Rhabditophora，切頭目降為切頭亞目Temnocephalida，歸屬于單腸目Rhabdocoela(汪安泰等，2005a)。

斯庫臺渦蟲屬Scutariella隸屬于扁形動物門被桿體綱單腸目斯庫臺科Scutariellidae。該科物種體表光滑，無纖毛，頭部有觸角，尾端有吸盤，部分種類具有柄，靜止時，隨水流擺動，以吸盤吸附在甲殼類額劍、足、口器等部位(Ohtakaetal.，2012)，移動時呈尺蠼式運動；具有吸食宿主血淋巴的習性，被認為是研究自由生活、外共生、寄生生活方式轉變的重要素材(Williams，1986)。一般認為其觸角、吸盤及柄為重要分類依據(Joffeetal.，1998)。

該屬迄今記錄4種，即ScutarielladidactylaMrazek，1907、S.georgicaJoffe & Djanashvili，1981、S.stammeriMatjasic，1958及S.japonica(Matjasic，1990)，其中，S.japonica最早的學名是CaridinicolasinicaMatjasic，1990，后由Kawakatsu等(1999)重新定名為日本斯庫臺渦蟲S.japonica。亞洲僅記錄日本斯庫臺渦蟲(Kawakatsuetal.，1999)。據Ohtaka等(2012)報道，日本斯庫臺渦蟲在日本和中國東南區(qū)域有分布。

本研究在廣東省河源市溪流內采集到斯庫臺渦蟲屬標本，對其展開形態(tài)學、組織學、分類學以及18S rDNA和28S rDNA系統(tǒng)進化分析，并與日本斯庫臺渦蟲做了仔細對比與討論，最后鑒定為中國斯庫臺渦蟲，新種Scutariellasinensissp. nov.。

1 材料方法

1.1 采集與培養(yǎng)

標本采自廣東省河源市東源縣(115°3′E，23°58′N)水溝。用200目浮游生物網在水溝中來回掃網，網內物置于桶中擺洗，靜置10 min，用60目網濾除粗渣，最后用200目網濃縮后裝入保鮮盒，帶回實驗室分離。分離的渦蟲在器皿中饑餓處理備用。

1.2 標本制備

方法同林逸濤等(2017)，使用生境水配制的5%～7%乙醇麻醉液處理標本，改良Bouin氏液(甲醛∶乙酸∶飽和苦味酸∶水=15∶8∶70∶7)固定1 h，水洗2 d。石蠟切片與模式標本制作使用HE染色法，常規(guī)方法制片。石蠟切片使用萊卡切片機(Leica RM2235)，切片厚6 μm。

1.3 分子系統(tǒng)學分析

試劑及方法見林逸濤等(2017)。18S rDNA引物為TimA、TimB和Poly18SR2，28S rDNA引物為LSU5、LSUD6-3、Poly28SF1和Poly28SR2(表1)。所用引物均由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。分子系統(tǒng)學分析所用序列均來源于GenBank(表2)。本文將中國斯庫臺渦蟲3個個體與切頭總科Temnocephaloidea中4屬各1種，單腸目中3亞目渦蟲各3種，吸蟲綱Trematoda中3種，水螅綱Hydrozoa中1種的18S rDNA和28S rDNA基因拼接序列，MEGA 6.0進行序列對比，刪減序列至最短。

表1 引物及PCR條件Table 1 Primers and PCR protocols

使用MEGA 6.0與MrBayes分別完成最大似然樹與貝葉斯樹構建，其中，貝葉斯樹用FigTree v1.4.3修飾并導出。

1.4 觀察與測量

同林逸濤等(2017)。

1.5 縮寫詞

b.腦brain，e. 眼eyes，eg. 嗜曙紅腺eosinophilic glands，g. 生殖腔gonocoel，go. 生殖孔genital opening；i. 腸intestines，m. 口mouth，o. 卵巢ovary，od. 輸卵管oviduct，p. 咽pharynx，pg. 咽腺pharyngeal glands，ps. 交配刺penis stylet，rs. 受精囊receptaculum seminalis，s. 吸盤sucker，t. 精巢testis，te. 觸角tentacle，vd. 輸精管vas deferens，vg. 卵黃腺vitelline glands，vgd. 卵黃腺管vitelline glands duct，vs. 儲精囊vesicula seminalis。

表2 物種基因序列的GenBank登錄號Table 2 GenBank accession numbers of the sequences

2 結果

2.1 中國斯庫臺渦蟲，新種Scutariella sinensis sp. nov. Wang & Chen(圖1，圖2)

模式標本：正模PLA-Sc001(扁形動物門-斯庫臺渦蟲屬)，整裝片，于2017年1月采自廣東省河源市(115°3′E，23°59′N)水溝，水溫18 ℃，采集人張呂。副模PLA-Sc002，整裝片；PLA-Sc003，連續(xù)切片，采集記錄同正模。所有標本均保存于中國科學院國家動物博物館。

整體形態(tài)：蟲體扁平，光滑，乳白色，長2 460～2 610 μm，寬300～330 μm(n=3，圖1：A～B；圖2：A)。2個觸角位于蟲體前端，呈指狀，分7節(jié)，可伸縮，長70～96 μm，基部長約180 μm，基部寬約100 μm(圖1：A～D；圖2：A)，口位于兩觸角間，花萼狀。咽位于口道后方，呈子彈頭形，長600～640 μm，基部寬100～120 μm(n=3)，其上分布有豐富的神經細胞。咽后連接腸道，咽與腸交界處的外側分布有咽腺(圖1：C～D；圖2：A)。兩眼點對稱分布于蟲體前1/3 處，呈半月狀，凹面向內，長26～29 μm，寬16～17 μm(n=3)。腦位于眼點腹側，具腦室(圖1：C～D，H)。腸為長筒狀，長960～1 000 μm，寬70～80 μm(n=3)。蟲體尾部具“C”形吸盤，不具柄。

生殖系統(tǒng)(圖1：C～G；圖2：A～D)：雄性生殖系統(tǒng)由精巢、輸精管、儲精囊、交配刺構成。精巢呈橢圓形，位于腸的前1/3兩側，長200～215 μm，寬100～129 μm(n=3)。精巢的前部為精子，后部為精原細胞。輸精管基部膨大與精巢前部融合，具貯存精子的作用。2條輸精管向體中軸延伸匯合為輸精總管，再向后延伸連接至儲精囊。儲精囊位于腸的前1/3處的腹側，近球形，長51～61 μm，寬38～42 μm(n=3)。交配刺起始于儲精囊，呈細管狀，長446～451 μm(n=3)，外被套膜，末端開口于生殖腔。生殖腔位于咽后腸前端腹側，長80～85 μm，寬54～57 μm(n=3)。生殖腔周圍組織內分布有卵殼腺。雌性生殖系統(tǒng)由卵巢、受精囊、輸卵管和卵黃腺構成。卵巢位于腸的前1/3位置的腹側，2個精巢之間，球形，長130～132 μm，寬135～138 μm(n=3)，其右后方有1根輸卵管通往生殖腔后端。輸卵管兩端管徑較大，長117～140 μm (n=3)。受精卵經輸卵管移至生殖腔完成剩余發(fā)育過程。受精囊位于卵巢和輸卵管交界處，球形，長41～42 μm，寬30～35 μm(n=3)，儲存有異體精子。2條卵黃腺始于咽后兩側，沿腸道兩側向后延伸，在腸道后部背側匯合，整體呈顯著的“U”型。卵黃管分別從左側卵黃腺前1/3處與右側卵黃腺1/2處發(fā)出，共同匯合于輸卵管近受精囊一端。所有標本中均發(fā)現(xiàn)大型卵黃腺細胞。

圖1 中國斯庫臺渦蟲，新種
Fig. 1Scutariellasinensissp. nov.

A. 收縮時自然形態(tài)； B. 舒展時自然形態(tài)(暗視野)； C. 整體壓片(HE染色)； D～I. 矢狀切片(D～F. 近腹側，示生殖腔、咽腺、嗜曙紅腺)； G. 大型卵黃腺細胞； H. 咽； I. 腸后愈合的卵黃腺； 比例尺： A～C=200 μm， D～I=50 μm

A. living specimen when contract； B. living specimen when relax (dark field view)； C. whole-mounted specimen (HE staining)； D-I. sagittal sections (D-F. ventral view， showing gonocoel， pharyngeal gland， eosinophilic glands)； G. large cells of vitelline glands； H. pharynx； I. fused vitelline glands at the posterior end of the intestine； scale bars： A-C=200 μm， D-I=50 μm

圖2 中國斯庫臺渦蟲，新種模式圖Fig.2 Scutariella sinensis sp. nov. patterns

A. 整體形態(tài)(腹面觀)； B. 眼點局部圖； C.生殖系統(tǒng)； D. 卵巢、輸卵管、受精囊、卵黃腺管交匯位置； 比例尺： A～B=200 μm，C=100 μm，D=50 μm

A. whole specimen (ventral view)； B. partial organizations around eyes； C. the reproductive systems； D. the fusing position for ovaries， oviduct， receptaculum seminalis， vitelline ducts； scale bars： A-B=200 μm， C=100 μm， D=50 μm

2.2 分子系統(tǒng)學結果

18S rDNA 和28S rDNA均具有高度保守性，因此常將二者作為確定物種進化地位的重要依據，并以此判斷物種間親緣關系。本研究中最大似然樹和貝葉斯樹的拓撲結構基本一致(圖3)。珠江水螅Hadrazhujiangensis作為外群位于系統(tǒng)樹最基部，中國斯庫臺渦蟲，新種3個個體聚為一支，并與切頭亞目其他3種渦蟲Diceratocephalaboschmai、Temno-sewelliaminor、Temnocephalafasciata及Didymorchissp.以100%的支持率聚為一支。此支系以90%以上支持率與達氏亞目Dalyellioida支系和盲扁亞目Typhioplanoida支系分離。三支系彼此獨立，在分子進化上存在較大差異，在分類地位上處于相同等級，共同隸屬于單腸目。且切頭亞目支系與吸蟲綱不存在親緣關系。

圖3 18S rDNA和28S rDNA拼接系統(tǒng)進化樹
Fig. 3 Phylogenetic tree of 18S rDNA and 28S rDNA

A. 最大似然樹(bootstrap=1 000， Tamura-Nei type)； B. 貝葉斯樹

A. Maximum Likelihood tree (bootstrap=1 000， Tamura-Nei type)； B. Bayesian tree

3 討論

斯庫臺渦蟲屬迄今已知4個物種：S.didactylaMrazek， 1907分布于黑山共和國，S.georgicaJoffeetal.， 1981分布于西格魯吉亞，S.stammeriMatjasic， 1958分布于波黑，日本斯庫臺渦蟲分布于日本千葉市(Kawakatsuetal.，1999)。上述物種在動物地理方面均屬于古北界。日本學者在中國的廣東、福建、江西、安徽及浙江采集到斯庫臺渦蟲屬物種，認為其是日本斯庫臺渦蟲(Ohtakaetal.，2012)。

S.stammeri體長1.3～1.5 mm，常出現(xiàn)眼點丟失(Matjasic，1958)。S.didactyla眼點位于咽和腸交界處，卵黃腺在中間分段，完全包裹腸道(Mrazek，1907)。S.georgica具2對左右對稱的卵黃腺，腸中部內陷(Joffe & Dzhanashvili，1981)。中國斯庫臺渦蟲，新種體長約2.5 mm，眼點位于咽外側，腸道無內陷，2支卵黃腺沿腸道兩側分布，并在腸后端背側匯合，整體呈“U”型，與上述3個物種區(qū)別十分顯著。

日本斯庫臺渦蟲的形態(tài)學數據不夠完善，之后有學者做了一些補充(Kawakatsuetal.，1999)，但仍缺乏細致的相關數據：無咽腺與卵黃管分布描述，未指明精巢內精子及精原細胞的分布特征。該物種主要特征：受精囊與卵巢相距較遠。子宮與生殖孔位于咽后腹側，腸長度的前1/4位置，與輸卵管直接相連，交配刺與子宮共同開口于生殖孔。卵黃腺分為4條，分布于腸的2側。

中國斯庫臺渦蟲，新種Scutariellasinensissp. nov.(Ss)與日本斯庫臺渦蟲Scutariellajaponica(Sj)在形態(tài)學上較為相似，二者的鑒別特征乃存在明顯差異：(1)Ss的2支卵黃腺在背部兩側沿腸管分布，在近腸后部愈合，整個卵黃腺呈“U”型，Sj的卵黃腺在腸后部不愈合；(2)Ss的生殖孔位于腸前端腹側，Sj的生殖孔位于腸腹側的前1/4處；(3)Ss的咽腺豐富，位于咽腸交界處的兩側，Sj無咽腺；(4)Ss的精巢、卵巢位于腸道前1/3腹側，Sj的精巢、卵巢位于腸道中部腹側。故新種是成立的。

本研究首次提供了斯庫臺科物種的分子系統(tǒng)學數據。至于在中國的廣東、福建、江西、安徽及浙江采集到的日本斯庫臺渦蟲(Ohtakaetal.，2012)，本文認為，有可能是中國斯庫臺渦蟲。目前尚未見日本斯庫臺渦蟲的分子系統(tǒng)學數據，這個問題有待后續(xù)研究。

國際動物學界對渦蟲研究已有200年歷史，資源探索接近尾聲。中國學者對渦蟲的研究起步較晚，進展緩慢，現(xiàn)仍處于起步階段(孫婷等，2016)。21世紀前，中國共發(fā)現(xiàn)渦蟲21種，21世紀以來，共發(fā)現(xiàn)渦蟲51種(Sunetal.，2015；Fangetal.，2016；Heetal.，2016；Dongetal.，2017；Linetal.，2017a，2017b；Wangetal.，2017)，其中，單腸目渦蟲共3科5屬26種(張呂等，2017；林逸濤等，2017；Linetal.，2017a)。其中，達氏科Dalyelliidae共19種(Tu，1934；汪安泰，2004；汪安泰，李慧，2005；汪安泰，吳海龍，2005a，2005b；汪安泰，鄧利，2006；汪安泰，吳海龍，2008；張小英等，2010；汪安泰，孫源，2011；賴曉婷等，2013；Luetal.，2013；Xiaetal.，2014；Zhangetal.，2014；容粗徨等，2016；Linetal.，2017a；張呂等，2017)，多數分布于廣東省沿海地區(qū)，海棲類單腸目渦蟲的生物多樣性研究才開始(Linetal.，2017a)。中國在動物地理方面橫跨古北界和東洋界，自然地理、氣候與生境十分多樣，海岸線超過30 000 km，預示有更多的物種待發(fā)現(xiàn)。

致謝：2013級張呂同學多次協(xié)助采集本文樣本，謹此感謝！

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