普洱茶、紅茶、綠茶中真菌毒素的檢測(cè)

王鷺+楊驊+謝國(guó)祥+賈偉

[摘要] 檢測(cè)茶葉中黃曲霉毒素（B1，B2，G1和G2）、伏馬霉素（FB1， FB2， FB3）和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，明確茶葉中的真菌毒素含量范圍并為茶葉監(jiān)管提供依據(jù)。采用有機(jī)溶劑（0.1%甲酸乙腈溶液）以及80 ℃熱水2種方法提取茶葉中的真菌毒素，利用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）法進(jìn)行分析測(cè)定。黃曲霉毒素B1，G1的線性范圍為39.1～5 000 ng·L-1，黃曲霉毒素B2，G2的線性范圍為 117～15 000 ng·L-1；伏馬霉素（FB1， FB2， FB3）的線性范圍為2.44～313 ng·L-1；脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的線性范圍為3 125～5 000 ng·L-1。所得8種真菌毒素的回歸方程均有良好的線性關(guān)系 （r≥0.999 0），回收率為85.7%～99.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差<10%。對(duì)20種國(guó)際市售茶葉中的8種真菌毒素進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示采用有機(jī)溶劑提取法，包括普洱茶、紅茶、綠茶在內(nèi)的多種茶葉產(chǎn)品都不同程度含有微量的真菌毒素，其中黃曲霉毒素B2在6種茶葉產(chǎn)品中被檢測(cè)到，黃曲霉毒素G1在3種茶葉中被檢測(cè)到，伏馬霉素FB1在2種茶葉中被檢測(cè)到，伏馬霉素FB2在一種茶葉中被檢測(cè)到。而采用熱水提取方法，只有一種茶葉產(chǎn)品的茶湯中檢測(cè)到微量的伏馬霉素B1，B2，其他各種茶葉的茶湯中均未檢出毒素。以上2種方法檢出的真菌毒素含量在0.15～7.31 μg·kg-1，均未超過(guò)國(guó)際食品安全規(guī)定的真菌毒素限量。80 ℃熱水提取模擬實(shí)際的飲茶方法，更能準(zhǔn)確地檢測(cè)茶葉中進(jìn)入茶湯的真菌毒素，適用于茶葉（采用熱水沖泡的）飲用產(chǎn)品，而有機(jī)溶劑萃取法適用于食用產(chǎn)品中霉菌毒素絕對(duì)含量的檢測(cè)。

[關(guān)鍵詞] 黃曲霉毒素； 伏馬霉素； 脫氧雪腐鐮刀菌烯醇； 液質(zhì)聯(lián)用； 普洱茶； 紅茶； 綠茶

[Abstract] To establish a robust method for the determination of mycotoxins in tea samples， and to provide means for the quality and safety control of tea products. Samples of 20 tea products acquired from international market were extracted by organic solvents （acetonitrile containing 0.1% formic acid） or hot water， respectively. The extracts were analyzed by UPLC-MS/MS.A good linear regression was achieved in a range of 39.1 to 5 000 ng·L-1for aflatoxin B1 （AFB1） and aflatoxin G1 （AFG1）， 117 to 15 000 ng·L-1 for aflatoxin B2 （AFB2） and aflatoxin G2 （AFG2）， 2.44 to 313 ng·L-1for fumonisin B1 （FB1）， fumonisinB2 （FB2） and fumonisin B3 （FB3）， and 3 125 to 5 000 ng·L-1for deoxynivalenol， with recovery rates between 85.7% and 99.6%. The coefficient of the linear equation for all standards was greater than 0.999 0， and the RSD value was less than 10%. Mycotoxins were detected in several tea samples using the two extraction methods but with different outcomes. The levels of mycotoxins detected ranging from 0.15 to 7.31 μg·kg-1 were well below the State or US FDA regulation limits of mycotoxins in food products. Both methods are simple， accurate， and sensitive， and thus， suitable for the quantitative determination of mycotoxins in different food products. The method with the 80 ℃ hot-water extraction is more appropriate to determine the trace amounts of mycotoxins in tea leaves that are likely to be present in brewed tea liquor， while organic solvent method is more suitable for the detection of mycotoxins in ingestible foods.

[Key words] aflatoxins； fumonisins； deoxynivalenol； UPLC-MS/MS； pu-erh tea； black tea； green tea

中國(guó)是茶的故鄉(xiāng)和茶文化的發(fā)源地，茶的發(fā)現(xiàn)和利用在中國(guó)已有數(shù)千年的歷史，唐代陸羽《茶經(jīng)》中認(rèn)為最早利用茶的是神農(nóng)氏—— “茶之飲，發(fā)乎神農(nóng)”。傳說(shuō)中“神農(nóng)嘗百草，日遇七十二毒，得茶而解之，”從那時(shí)起古人就知道飲茶可健身，有治病之療效。到了近代，隨著科技的進(jìn)步、研究方法的不斷改進(jìn)，人們發(fā)現(xiàn)茶葉中含有很多活性成分，包括茶多酚、咖啡因、黃酮、三萜及其苷類等，這些活性成分具有預(yù)防心血管疾病、降血脂、降血壓、抑菌、調(diào)節(jié)血糖以及防治神經(jīng)退行性疾病等多種功效[1-3]。endprint

中國(guó)出產(chǎn)的名茶眾多，其中綠茶、紅茶和普洱茶是國(guó)內(nèi)市場(chǎng)最受歡迎的茶葉品類[4]。同時(shí)中國(guó)也是茶葉的產(chǎn)銷大國(guó)，很多茶葉品種尤其是發(fā)酵茶如普洱茶在生產(chǎn)加工和保存過(guò)程中，存在真菌毒素污染的可能。黃曲霉毒素（aflatoxins， AF）是由黃曲霉和寄生曲霉代謝產(chǎn)生的一類結(jié)構(gòu)類似的化合物，是一種天然存在的最強(qiáng)致癌物之一，主要有B1， B2， G1， G2 4種，又以B1的毒性最強(qiáng)[5]。伏馬菌素（fumonisins， FB）是最近發(fā)現(xiàn)的、由串珠鐮刀菌等產(chǎn)生的一種新型、強(qiáng)毒性的生物毒素，主要包括FB1，F(xiàn)B2，F(xiàn)B3。伏馬霉素同黃曲霉素一樣，廣泛存在于各種農(nóng)作物和農(nóng)作物副產(chǎn)品中，對(duì)人體健康有很大的潛在危害并且會(huì)導(dǎo)致肝癌，還可能誘發(fā)其他臟器癌變[6]。脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol） 同樣也是最常見(jiàn)的一類污染性真菌毒素，食用低劑量的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇會(huì)引起食欲下降、嘔吐等癥狀[7] 。因此，嚴(yán)格控制茶葉中的真菌毒素含量與百姓的安全健康息息相關(guān)。

目前真菌毒素的檢測(cè)方法主要有酶聯(lián)免疫吸附法[8]、免疫親和凈化-HPLC[9-11]、免疫親和柱色譜-酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）[12-13]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS法）[14-19]。酶聯(lián)免疫吸附法、免疫親和色譜-HPLC、免疫親和柱色譜-酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）等受茶葉中茶多酚和茶色素的干擾，在測(cè)定真菌毒素時(shí)產(chǎn)生“假陽(yáng)性“結(jié)果。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，具有靈敏度高、選擇性好、多種組分同時(shí)檢測(cè)等技術(shù)優(yōu)點(diǎn)， 當(dāng)前廣泛應(yīng)用于食品中真菌毒素檢測(cè)[20]。基于此，本研究采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)包括普洱茶、紅茶、綠茶在內(nèi)的20種國(guó)際市售茶葉中黃曲霉毒素B1， B2， G1， G2，伏馬霉素FB1， FB2， FB3和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol）進(jìn)行檢測(cè)。

除了采用常規(guī)的有機(jī)溶劑萃取的方法對(duì)茶葉中的真菌毒素進(jìn)行提取，本研究還模擬實(shí)際的飲茶方法采用80 ℃熱水分不同的時(shí)間段進(jìn)行提取，更能準(zhǔn)確地檢測(cè)茶葉中進(jìn)入茶湯的霉菌毒素。從而為明確茶葉中的霉菌毒素含量，加強(qiáng)茶葉衛(wèi)生管理、制定相關(guān)衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)提供了更全面的技術(shù)基礎(chǔ)和資料。

1 材料

AcquityTM超高效液相色譜儀和XevoTM TQ-MS質(zhì)譜儀器（美國(guó)Waters 公司）；Allegra X-15R 和Microfuge 22R 離心機(jī)（美國(guó)Beckman Coulter公司）；Multi-THERM型冷卻/加熱振蕩器（美國(guó)Benchmark Scientific公司）；I24 振蕩器（英國(guó)New Brunswick Scientific公司）；凍干機(jī)（美國(guó)Labconco公司）， XP105DR 型1/10萬(wàn)電子分析天平（瑞士Mettler公司）；氮?dú)獍l(fā)生器（Peak Scientific）；Milli-Q超純水處理系統(tǒng)。

黃曲霉毒素混合對(duì)照品（黃曲霉毒素 B1， B2， G1， G2）購(gòu)于美國(guó) Sigma公司（批號(hào)A0263）；對(duì)照品伏馬菌素 B1（批號(hào) 62580）、伏馬菌素 B2（批號(hào) 13227）、伏馬菌素 B3（批號(hào) 20434）、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（批號(hào)11428）均購(gòu)于美國(guó)Cayman公司；色譜純甲醇、乙腈、甲酸、二甲基亞砜（美國(guó)Sigma公司）；水為高純水；氯化鈉（純度>99.9%）、硫酸鎂（美國(guó)Fisher 公司）；C18硅膠（60A級(jí)）購(gòu)于美國(guó)Sorbtech公司。本研究所檢測(cè)茶葉樣本為隨機(jī)抽取的國(guó)際茶葉市場(chǎng)共20種茶葉樣品，其中有8種茶葉購(gòu)自日本茶商LUPICIA。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為UPLC ACQUITY BEH C18柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液（A）-0.1%甲酸乙腈（B），梯度洗脫（0～3.0 min，10%B；3.0～10 min，10%～70% B；10～10.1 min，70%～10% B；10.1～13 min，10% B），流速0.4 mL·min-1，柱溫40 ℃，進(jìn)樣量5 μL。

2.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（ESI）正離子模式；多反應(yīng)檢測(cè)模式（MRM）；毛細(xì)管電壓1.0 kV；脫溶劑氣溫度400 ℃；錐孔流速150 L·h-1；脫溶劑氣流速600 L·h-1。其他質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。混合對(duì)照品的典型色譜圖見(jiàn)圖1。

2.3 溶液的制備

2.3.1 對(duì)照品溶液

精密稱取上述8種對(duì)照品適量，加甲醇定容至刻度，搖勻，制成質(zhì)量濃度均為1.0 g·L-1的對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取各對(duì)照品儲(chǔ)備液適量置于同一量瓶中，定容至刻度，制得質(zhì)量濃度均為1.0 mg·L-1的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。以甲醇稀釋成系列質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液。

2.3.2 樣品處理

2.3.2.1 有機(jī)相萃取 稱取粉碎后的樣品0.3 g 于50 mL具塞離心管中，加入10 mL 乙腈-0.2%甲 酸水（1∶1），超聲提取30 min。之后加入2.0 g硫酸鎂和0.5 g氯化鈉，渦旋5 min，4 000 r·min-1離心10 min。吸取2.0 mL上清液至5.0 mL 具塞離心管中，加入0.1 g C18硅膠和0.3 g硫酸鎂，渦旋5 min，4 000 r·min-1離心10 min，吸取1.0 mL上清液至另一試管中，再加入200 μL二甲基亞砜，氮?dú)獯蹈桑尤?00 μL甲醇復(fù)溶，渦旋振蕩30 s，經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾，供檢測(cè)使用。

2.3.2.2 水相萃取 考慮到日常泡茶、飲茶習(xí)慣，采用如下2種熱水提取方法進(jìn)行茶葉中毒素的萃取檢測(cè)。①稱取粉碎后的樣品1.0 g于50 mL具塞離心管中，加入20 mL 80 ℃熱水。在0.5，1，3，6，12 h后，分別吸取1.2 mL的樣品溶液到1.5 mL的離心管中，使用4 000 r·min-1離心10 min，再分別吸取1.0 mL上清液至1.5 mL 離心管中，冷凍干燥后加入800 μL甲醇溶解，渦旋振蕩30 s，離心后上清液供檢測(cè)使用。②稱取粉碎后的樣品1.0 g于50 mL具塞離心管中，加入20 mL 80 ℃熱水。在0.5，1，3，6，12 h后，分別吸取1.2 mL的樣品溶液到1.5 mL的離心管中。每一時(shí)間點(diǎn)均棄去剩余水溶液，并重新加入20 mL 80 ℃熱水。水提液經(jīng)4 000 r·min-1離心10 min，再分別吸取1.0 mL上清液至1.5 mL 離心管中，冷凍干燥后加入800 μL甲醇溶解，渦旋振蕩30 s，離心后上清液供檢測(cè)使用。endprint

2.4 線性關(guān)系檢測(cè)限和定量限考察

分別精密吸取混合對(duì)照品溶液適量，加甲醇溶液稀釋至不同質(zhì)量濃度，渦旋，制得系列混合對(duì)照品溶液，分別取以上混合對(duì)照品溶液按2.1和2.2項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)行測(cè)定。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。用加權(quán)最小二乘法（W=1/x2）計(jì)算回歸方程。以0.3 g茶葉樣本計(jì)算得到有機(jī)相萃取和1.0 g茶葉樣本計(jì)算得到的水相萃取的定量下限見(jiàn)表2。

2.5 加樣回收率考察

取上述8種真菌毒素未檢出的空白茶葉樣品，平行取6份，加入混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按2.3.2項(xiàng)樣品處理方法制備樣品并進(jìn)行回收測(cè)定，得到本實(shí)驗(yàn)的平均回收率和精密度，見(jiàn)表3。

2.6 樣品測(cè)定

采用2.3.2項(xiàng)方法處理茶葉樣本，在上述儀器測(cè)定條件下對(duì)20種茶葉進(jìn)行測(cè)定。將樣本中檢測(cè)到的真菌毒素的峰面積代入表2 方程，計(jì)算得到樣本中真菌毒素的實(shí)際濃度。有機(jī)相萃取結(jié)果見(jiàn)表4， 在6種茶葉中檢測(cè)到黃曲霉毒素B2，在3種茶葉中檢測(cè)到黃曲霉毒素G1，在2種茶葉中檢測(cè)到伏馬霉素B1和在1種茶葉中檢測(cè)到伏馬霉素B2。水提取樣本中，僅一種茶葉（糯香普洱）檢出伏馬霉素B1以及伏馬霉素 B2，結(jié)果見(jiàn)表5，其余樣本均未檢出。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)建立的定量分析茶葉中8種真菌毒素UPLC-MS/MS方法，在其各自的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，線性良好，所有測(cè)定樣品的準(zhǔn)確度，回收率等均滿足定量分析要求。

對(duì)市售的20種茶葉樣本進(jìn)行測(cè)定，采用有機(jī)溶劑提取，在2種普洱茶，3種綠茶和1種紅茶中檢出 了黃曲霉毒素B2；2種普洱茶和1種紅茶中檢出了黃曲霉毒素G1；2種普洱茶中檢出了伏馬霉素B1以及1種普洱茶中檢出了伏馬霉素B2。其中毒性最強(qiáng)的黃曲霉毒素B1并未檢測(cè)到，普洱茶產(chǎn)品并不比 其他的茶葉（紅茶、綠茶等）產(chǎn)品含有更多的霉菌毒素。而水相提取樣本除在1種糯香普洱產(chǎn)品中檢出微量的（0.15～3.33 μg·kg-1）伏馬霉素B1和B2以外，其余所測(cè)樣本中8種真菌毒素均未檢出。采用80 ℃熱水提取模擬實(shí)際的飲茶方法（單次沖泡和多次沖泡茶葉取樣），能更準(zhǔn)確地檢測(cè)茶葉中進(jìn)入茶湯的霉菌毒素，而有機(jī)溶劑萃取法更適合檢測(cè)食品中的霉菌毒素的含量。

美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局以及中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB2761《食品中真菌毒素限量》中規(guī)定食品、玉米、玉米制品、花生、花生制品中的黃曲霉素限量標(biāo)準(zhǔn)為20 μg·kg-1[21-22]；脫氧雪腐鐮刀菌烯醇在玉米、玉米面、大麥、小麥中的限量為1 000 μg·kg-1[9]；伏馬菌素歐盟限定標(biāo)準(zhǔn)為玉米和玉米制品中不得超過(guò)1 000 μg·kg-1[23]。從上述限量標(biāo)準(zhǔn)來(lái)看，黃曲霉毒素毒性最強(qiáng)，控制得最嚴(yán)。本研究所采用的2種方法對(duì)20種市售茶葉產(chǎn)品所檢出的幾種霉菌毒素含量在0.15～7.31 μg·kg-1，均未超過(guò)相關(guān)食品安全規(guī)定的真菌毒素限量。

黃曲霉毒素具有很高的脂溶性，難溶于水，茶葉受到黃曲霉菌污染，所含有的毒素只有少量會(huì)在沖泡過(guò)程中進(jìn)入茶湯。飲茶是用開(kāi)水泡茶，飲用的是茶湯，與玉米、花生等糧食在食用方法（后者全部入口）和用量上（前者幾克，后者往往數(shù)百克）相比有著根本的差異，所以評(píng)價(jià)飲茶中攝入的霉菌毒素不應(yīng)該采用糧食中檢測(cè)毒素的有機(jī)溶劑提取方法。事實(shí)上有人用有機(jī)溶劑提取法對(duì)西班牙超市中售賣的多種咖啡樣本進(jìn)行分析，檢測(cè)出多種霉菌毒素，其中有的超標(biāo)很高[14]。所以食品安全評(píng)價(jià)中的分析方法不當(dāng)，會(huì)夸大問(wèn)題，引起大眾不必要的恐慌。

另外，包括黃曲霉菌在內(nèi)的常見(jiàn)寄生霉菌，廣泛存在于生長(zhǎng)溫度為25～40 ℃的溫暖地區(qū)，因此位于熱帶地區(qū)或者常溫條件下的實(shí)驗(yàn)室也容易受到污染，在食品分析過(guò)程中對(duì)于實(shí)驗(yàn)設(shè)備、材料、試劑等排除微量霉菌的污染，從而保證高靈敏的分析儀器不受干擾，也是一個(gè)容易忽視卻又非常重要的質(zhì)量控制環(huán)節(jié)。

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[責(zé)任編輯 丁廣治]endprint