異種肝移植的研究進(jìn)展

竇科峰，李霄，楊佩軍，陶開(kāi)山（空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽外科暨全軍器官移植研究所，陜西 西安 710032）

隨著肝移植技術(shù)逐漸成熟，供肝短缺的問(wèn)題日益突出。據(jù)美國(guó)器官資源共享中心（United Network for Organ Sharing，UNOS）的數(shù)據(jù)顯示，美國(guó)平均每年實(shí)施約8 000例肝移植手術(shù)。但與此同時(shí)，每年約有1300例患者在等待肝臟的過(guò)程中死亡，還有1500例等待肝移植的患者因錯(cuò)過(guò)最佳移植時(shí)間而從等候名單上被移除［1］。我國(guó)的形勢(shì)則更為嚴(yán)峻，等待移植與供肝比例高達(dá)150∶1，絕大多數(shù)患者因缺乏供肝而死亡［2］。加強(qiáng)公民死后器官捐獻(xiàn)的宣傳、擴(kuò)大心臟死亡器官捐獻(xiàn)（donation after cardiac death，DCD）數(shù)量，推廣活體肝移植、劈裂式肝移植技術(shù)，發(fā)展生物人工肝技術(shù)、培育人源化肝臟等，都是擴(kuò)大供體來(lái)源、緩解供體短缺的有效方法，但目前效果還比較有限，短期內(nèi)無(wú)法突破供體短缺的困境。

以豬為供體的異種肝臟移植在此背景下應(yīng)運(yùn)而生。當(dāng)前，異種肝移植主要考慮應(yīng)用于急性暴發(fā)性肝衰竭患者，在其等待同種供肝的過(guò)程中能夠維持患者的肝功能，以發(fā)揮“橋接過(guò)渡”治療的作用［3］。和非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物相比，以豬作為供體具有很多優(yōu)勢(shì)。首先，豬易于飼養(yǎng)、繁殖快、成本低，且與人類(lèi)的解剖結(jié)構(gòu)、生理狀態(tài)近似；其次，對(duì)于豬的組織配型和基因修飾，目前已有成功的經(jīng)驗(yàn)和技術(shù)，因而豬是理想的異種移植供體來(lái)源［4］。

自1968—2012年，豬到非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物肝移植最長(zhǎng)存活時(shí)間僅為9天，造成受體死亡的主要原因是移植后的超急性免疫排斥反應(yīng)（hyper acute rejection，HAR）。隨著α-1，3-半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶（α-1，3-galactosy transferase，GGTA1）基因敲除（galactosyltransferase gene knockout，GTKO）小型豬的出現(xiàn)，HAR已基本得到控制，但隨后發(fā)生的血小板減少癥、血栓性微血管病變和致死性凝血調(diào)節(jié)功能障礙，成為造成受體死亡的主要原因［5］。近年來(lái)，在術(shù)后補(bǔ)充外源性凝血因子或聯(lián)合共刺激通路的阻斷，有效延長(zhǎng)了異種肝移植受體的存活時(shí)間，異種肝移植已具備進(jìn)入臨床試驗(yàn)的基本條件。在此背景下，本文試就豬到非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物的異種肝移植的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，并展望其不久后在臨床中的應(yīng)用價(jià)值。

1 異種肝移植的大動(dòng)物試驗(yàn)研究

1.1 以野生型豬為供體的異種肝移植試驗(yàn)：1968年，Calne進(jìn)行了第一次以豬為供體的異種肝移植的大動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。在7例野生豬到狒狒的異種肝移植中，受體最長(zhǎng)存活時(shí)間為3.5天，存活最長(zhǎng)的受體應(yīng)用糖皮質(zhì)激素和硫唑嘌呤的免疫抑制方案，尸檢提示狒狒死于支氣管肺炎，肝臟病理顯示部分肝細(xì)胞存活，但匯管區(qū)有大量免疫炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)。兩年后，又進(jìn)行了以恒河猴和大猩猩為受體的再次嘗試，但結(jié)果仍不理想，受體存活時(shí)間均沒(méi)有超過(guò)12小時(shí)，死亡原因?yàn)閺浡匝軆?nèi)凝血（disseminated intravascular coagulation，DIC）。在接下來(lái)的20年里，研究者以野生豬為供體進(jìn)行了多次嘗試，但存活期始終沒(méi)有超過(guò)3天。這一階段的異種肝移植研究均以失敗告終。

1.2 以基因修飾豬為供體的異種原位肝移植試驗(yàn)：上述實(shí)驗(yàn)表明，由于物種間的不相容性，異種肝移植術(shù)后存在嚴(yán)重的HAR，導(dǎo)致受體存活時(shí)間較短。隨之發(fā)現(xiàn)HAR 是由靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物體內(nèi)預(yù)存的抗α-1，3-半乳糖（α-1，3-galactosy，α-1，3-Gal）的異種反應(yīng)性天然抗體，與廣泛表達(dá)于豬血管內(nèi)皮細(xì)胞上的α-1，3-Gal抗原結(jié)合，隨后激活補(bǔ)體和內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)，在數(shù)分鐘到數(shù)小時(shí)內(nèi)出現(xiàn)以間質(zhì)出血、水腫和小血管血栓形成為主要表現(xiàn)的免疫排斥反應(yīng)。隨著基因編輯技術(shù)的發(fā)展，轉(zhuǎn)人補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白或敲除天然抗原的基因修飾小型豬不斷問(wèn)世，異種肝移植研究進(jìn)入了快速發(fā)展階段［6］。

2000年，Ramirez實(shí)施了第一例以基因修飾豬為供體、狒狒為受體的原位異種肝移植。供體豬表達(dá)人補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白——衰變加速因子（human complement regulatory decay accelerating factor，h-DAF or CD55），顯著激活受體的補(bǔ)體調(diào)節(jié)功能，限制補(bǔ)體活化的強(qiáng)度，有效控制HAR 程度，狒狒術(shù)后存活時(shí)間達(dá)到8天，移植后的肝臟能夠在受體內(nèi)合成正常水平的有效凝血因子。該實(shí)驗(yàn)中存活時(shí)間最長(zhǎng)的狒狒后期出現(xiàn)嚴(yán)重的膿毒癥，因此執(zhí)行了安樂(lè)死。此后，Ramirez 又在供體內(nèi)轉(zhuǎn)入人補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白CD59 和α-1，2-巖藻糖轉(zhuǎn)移酶，雖然多基因修飾后的供肝在術(shù)后沒(méi)有出現(xiàn)明顯的超急性排斥并保持完整的肝臟結(jié)構(gòu)，但受體存活時(shí)間僅為13～24小時(shí)，其中3例受體出現(xiàn)內(nèi)出現(xiàn)血栓，1例受體出現(xiàn)不明原因的移植物失功能，這項(xiàng)研究宣告失敗。

除了在供體內(nèi)引入新基因，基因工程研究者還成功敲除了供體內(nèi)導(dǎo)致HAR的抗原基因。進(jìn)化上處于舊世界猴之前的哺乳動(dòng)物（包括豬）都會(huì)表達(dá)半乳糖抗原表位，而舊世界猴以后的哺乳動(dòng)物（包括人）體內(nèi)存在抗半乳糖的天然抗體。2002年和2003年，美國(guó)的兩個(gè)研究團(tuán)隊(duì)先后在Science和Nature上報(bào)道培育出GTKO豬。隨后全世界開(kāi)展了一系列以GTKO豬為供體，非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物為受體的異種肝移植試驗(yàn)，帶來(lái)了令人鼓舞的研究結(jié)果。Cooper等［7］和 Ekser等［8］首次應(yīng)用轉(zhuǎn)入 hCD46的GTKO 小型豬作為供體，實(shí)施異種肝移植，術(shù)后受體存活4～7天，且具有正常的蛋白合成功能，狒狒外周血中持續(xù)檢測(cè)到豬源白蛋白、纖維蛋白原、結(jié)合珠蛋白、纖溶酶原和凝血因子。但術(shù)后數(shù)小時(shí)受體即出現(xiàn)較為嚴(yán)重的血小板減少癥，并最終因嚴(yán)重的腹腔出血而死亡。Kim等［9］調(diào)整免疫抑制方案后，受體存活時(shí)間延長(zhǎng)至9天。存活時(shí)間最長(zhǎng)的2例受體術(shù)后持續(xù)應(yīng)用溶血酶抑制劑氨基己酸，抑制了受體內(nèi)纖維蛋白溶解，將血小板維持在40000/mm3。這些受體雖未出現(xiàn)致死性的血小板減少癥，但白細(xì)胞計(jì)數(shù)的持續(xù)升高和紅細(xì)胞、血小板計(jì)數(shù)的持續(xù)下降仍提示受體存在凝血功能障礙和膿毒血癥，并最終導(dǎo)致受體死亡，尸檢結(jié)果提示移植肝臟內(nèi)未出現(xiàn)明顯的急性細(xì)胞和體液免疫排斥反應(yīng)。

1.3 以基因修飾豬為供體的異種異位肝移植試驗(yàn)：2013年，第四軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院全軍器官移植研究所完成我國(guó)首次豬-猴異種肝移植大動(dòng)物試驗(yàn)。供體是中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所培育的GTKO小型豬，血型為O型。受體是四川醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所培育的藏酋猴，血型為A型。手術(shù)先切除藏酋猴的脾臟，而后將GTKO豬的部分肝臟植入脾窩，行受體左腎靜脈遠(yuǎn)端與移植肝門(mén)靜脈吻合、受體左腎靜脈近端與移植肝肝靜脈吻合、受體脾動(dòng)脈與移植肝肝動(dòng)脈吻合，并放置膽道引流管。術(shù)后采用“嗎替麥考酚酯膠囊+他克莫司+注射用巴利昔單抗+激素”的四聯(lián)免疫抑制方案，并應(yīng)用丹參抗凝。術(shù)后受體膽道引流管內(nèi)有金黃色透明膽汁持續(xù)流出，量為40～50 ml/d。肝功等生理、生化指標(biāo)逐漸恢復(fù)至生理范圍，未發(fā)現(xiàn)肝功能損害現(xiàn)象。凝血功能和血小板數(shù)量保持穩(wěn)定，未出現(xiàn)凝血系統(tǒng)功能紊亂、DIC等病理改變［10］。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測(cè)到受體血液中有豬源白蛋白和血小板活化因子存在，證明移植肝臟發(fā)揮正常的生理代謝功能，與猴子的自身肝臟“相互支持、和諧共存”。受體和移植肝臟存活2周，最終因長(zhǎng)期臥床導(dǎo)致墜積性肺炎、呼吸衰竭、心力衰竭而死亡。尸檢發(fā)現(xiàn)移植肝臟形態(tài)良好，顏色紅潤(rùn)，體積明顯增大，質(zhì)量約300g；病理檢查未發(fā)現(xiàn)超急性和急性免疫排斥反應(yīng)發(fā)生。

這項(xiàng)研究不僅是亞洲首例豬-猴異種肝移植試驗(yàn)，也是世界首例異種異位脾窩輔助性肝移植術(shù)，創(chuàng)造了當(dāng)時(shí)GTKO豬-非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物異種肝移植受體最長(zhǎng)存活時(shí)間記錄。與國(guó)外研究的異種原位肝移植術(shù)（切除受體肝臟后原位植入豬肝，并切除脾臟以控制免疫排斥）相比，該術(shù)式不損傷受體自身肝臟，在切除受體脾臟后，巧妙地將脾窩做為移植肝臟的“新家”。這不僅有利于控制免疫排斥反應(yīng)、促進(jìn)受體肝功能恢復(fù)，并能幫助維持正常的凝血和抗凝功能，防止發(fā)生凝血系統(tǒng)功能紊亂，避免出現(xiàn)異種肝移植術(shù)后常見(jiàn)的血小板匱乏和致命的廣泛性內(nèi)臟出血［11］。當(dāng)然，這些優(yōu)勢(shì)還需要大樣本量的動(dòng)物試驗(yàn)和基礎(chǔ)研究進(jìn)一步明確和證實(shí)。

在此基礎(chǔ)上，該研究小組還在世界上首次建立了永生化的GTKO豬肝細(xì)胞系HepDW細(xì)胞。該細(xì)胞目前已穩(wěn)定傳代至30代，其表面不表達(dá)Gal抗原，具備合成、分泌糖原和白蛋白的能力，并表達(dá)肝細(xì)胞核因子4α（hepatocyte nuclear factor 4α，HNF4α）、細(xì)胞色素CYP3A、谷氨酰胺合成酶、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶等肝細(xì)胞發(fā)揮代謝及功能的重要分子。在其培養(yǎng)上清中可檢測(cè)到尿素、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶的分泌，說(shuō)明該細(xì)胞具有氨代謝能力。該細(xì)胞具有正常豬肝細(xì)胞的全部功能且不表達(dá)Gal抗原，以其為基礎(chǔ)，可在體外構(gòu)建模擬異種移植肝病理變化的細(xì)胞模型，為研究移植肝損傷機(jī)制、篩選抗排斥藥物方案提供良好的體外實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

2014年，美國(guó)麻省總醫(yī)院也進(jìn)行了相同的異種異位輔助性肝移植試驗(yàn)，術(shù)后采用“激素+他克莫司”的免疫維持方案并補(bǔ)充外源性全譜系凝血因子。術(shù)后移植肝和受體存活15天，最終死于肝功能衰竭和感染［12］。該小組在2016年，又完成了6例GTKO小型豬-狒狒原位肝移植手術(shù)實(shí)驗(yàn)，術(shù)后仍然補(bǔ)充外源性全譜系凝血因子，最終移植肝和受體存活25天［13］。

1.4 補(bǔ)充外源性人凝血因子對(duì)緩解凝血功能障礙作用：凝血功能障礙是異種肝移植術(shù)后，受體不可避免出現(xiàn)的病理過(guò)程，表現(xiàn)為血小板減少、出血、血栓性微血管病變。目前認(rèn)為，導(dǎo)致凝血功能障礙的主要原因是受體外周血中的抗非半乳糖抗體激活了移植肝臟內(nèi)的血管內(nèi)皮細(xì)胞，從而引發(fā)凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)。此外，豬和非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物的凝血因子種類(lèi)及活性有較大差距［14］。有研究證實(shí)，異種肝移植術(shù)后受體狒狒體內(nèi)無(wú)法檢測(cè)到豬源性的凝血因子Ⅶ，而狒狒自身殘存的凝血因子Ⅶ也僅能在術(shù)后24小時(shí)內(nèi)檢測(cè)到，這提示凝血因子Ⅶ的缺乏與凝血調(diào)節(jié)功能障礙有密切關(guān)系?；谶@些發(fā)現(xiàn)，有研究者嘗試在術(shù)后早期給受體補(bǔ)充人源性的凝血因子，以解決移植術(shù)后的凝血功能障礙。試驗(yàn)中嘗試了兩種藥理作用不同的藥物，分別是含有因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ和Ⅹ以及蛋白C、蛋白S的第二代人源性凝血酶原復(fù)合物濃縮物Octaplex（human prothrombin complex concentrate，hPCC）和重組人活化因子Ⅶ。當(dāng)靜脈推注hPCC時(shí)，導(dǎo)致移植物血管中血栓形成，2例實(shí)驗(yàn)受體僅存活1天和3天。但在另外4例hPCC連續(xù)給藥的受體中，術(shù)中輸血需求大大減少，術(shù)后病理提示未發(fā)現(xiàn)血栓性微血管病變。實(shí)際上，在連續(xù)給藥的情況下，受體只需輸注200 ml血液即可存活1周，而在過(guò)去的豬-狒狒異種移植中受體存活同樣的時(shí)間需要輸注約600 ml 血液。此外，研究者還發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)充人源性的凝血因子后，受體的血小板數(shù)量能夠維持穩(wěn)定甚至有所回升［15］。

1.5 阻斷受體共刺激通路，降低免疫排斥反應(yīng)：在上述研究基礎(chǔ)上，Shah等［16］借鑒異種腎移植和心臟移植長(zhǎng)期存活的經(jīng)驗(yàn)，擬定了一套完整的豬-猴異種肝移植方案：使用不攜帶巨細(xì)胞病毒的GTKO豬作為器官來(lái)源，移植后補(bǔ)充人源性凝血因子，并應(yīng)用抗CD40的單克隆抗體以阻斷受體共刺激通路的活化。以該方案實(shí)施了4例豬-狒狒的異種肝移植，受體給予hPCC連續(xù)給藥，采用抗胸腺細(xì)胞球蛋白誘導(dǎo)，他克莫司、甲潑尼龍、貝拉希普（n=3）或抗CD40單克隆抗體（n=1）維持治療的免疫抑制方案。4只狒狒異種肝移植后輸血需求明顯減少，且最長(zhǎng)存活了29天，這也是目前異種肝移植受體的最長(zhǎng)存活時(shí)間［16］。該研究表明異種肝移植物可以在非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物體內(nèi)維持其肝臟代謝功能，可以考慮將其用于急性肝衰患者接受同種肝移植之前起到過(guò)渡作用。

2 異種肝移植臨床試驗(yàn)研究

1992年10月11日，在無(wú)合適同種供肝的情況下，美國(guó)洛杉磯西代細(xì)納醫(yī)院的Makowka 為1例因自身免疫性肝炎所致暴發(fā)性肝功能衰竭的3～4級(jí)肝昏迷患者實(shí)施輔助性肝移植（右肝下），供肝來(lái)自野生型的尤卡坦豬（體重20kg），意圖做暫時(shí)的過(guò)渡性治療，使患者能夠度過(guò)危險(xiǎn)的肝昏迷期［11］。術(shù)前采用血漿洗脫法和特異性抗體移出法對(duì)患者進(jìn)行預(yù)處理，清除了受體循環(huán)血液中90%的抗豬天然抗體，減輕HAR。術(shù)后采用“環(huán)孢素A+環(huán)磷酰胺+前列環(huán)素E1+硫唑嘌呤”的四聯(lián)免疫抑制治療方案。手術(shù)獲得了成功，術(shù)后6小時(shí)后看到金黃色的膽汁不斷流出，除了中樞神經(jīng)系統(tǒng)，各個(gè)器官系統(tǒng)的功能都有明顯的改善。受體乳酸清除率改善、凝血酶原時(shí)間穩(wěn)定、血清膽紅素和轉(zhuǎn)氨酶水平下降，都提示異種肝臟發(fā)揮了一定的功能。同時(shí)，受體顱內(nèi)壓持續(xù)下降，凝血功能也逐漸轉(zhuǎn)向正常。但令人惋惜的是，在合適的人供肝到來(lái)前2小時(shí)，患者腦壓突然迅速回升，最終因發(fā)生小腦腦疝而導(dǎo)致死亡。最終，供肝有功能存活20小時(shí)，受體存活34小時(shí)。尸檢發(fā)現(xiàn)移植肝臟內(nèi)有抗體和補(bǔ)體成分沉積，肝動(dòng)脈、中心靜脈、門(mén)靜脈出現(xiàn)廣泛的出血性壞死和多個(gè)不同血管的大量閉塞性血栓形成，內(nèi)皮細(xì)胞腫脹明顯，發(fā)生了抗體介導(dǎo)的HAR所致的大面積肝組織梗死，提示受體循環(huán)血液內(nèi)的異種抗體清除后可迅速形成大量的新的抗豬抗體。

這是目前僅有的1例以豬為供體的臨床異種肝移植實(shí)驗(yàn)，雖然結(jié)果不理想，但最為重要的是證明了豬的肝臟可在人體內(nèi)發(fā)揮一定的代謝功能，能夠?yàn)榧毙愿喂δ芩ソ呋颊咛峁┮欢螘r(shí)間的肝功能支持，從而起到“橋接”同種肝移植治療的目的［17］。

3 臨床試驗(yàn)展望

隨著異種肝移植動(dòng)物實(shí)驗(yàn)存活時(shí)間的不斷延長(zhǎng)，異種肝移植越來(lái)越接近臨床試驗(yàn)，但要開(kāi)展安全、有效、符合倫理的臨床試驗(yàn)，關(guān)鍵的問(wèn)題是選擇合適的受者。筆者考慮，初期臨床試驗(yàn)應(yīng)主要選擇急性暴發(fā)性肝功能衰竭、早期移植肝失功能及慢性肝病急性失代償?shù)幕颊?。這些患者無(wú)法及時(shí)獲得肝源，同時(shí)也缺少其他可以替代的有效治療方法，如果不接受肝移植，病死率高達(dá)80%。據(jù)統(tǒng)計(jì)，急性肝衰患者在死亡前登記在等候名單上的平均時(shí)間只有3天，而對(duì)于成功的接受了肝移植手術(shù)的急性肝衰患者，接近2/3的人存活時(shí)間可超過(guò)2年［18］。因此，可以嘗試將異種肝移植作為橋接，延長(zhǎng)這類(lèi)患者的生存時(shí)間，直到得到合適的肝源進(jìn)行同種肝移植。而在這個(gè)過(guò)程中，如能證實(shí)異種肝移植的安全性和有效性，異種肝移植可最終作為終末期肝病的有效治療手段應(yīng)用于臨床。

4 總 結(jié)

經(jīng)過(guò)100余年的發(fā)展，異種器官移植已進(jìn)入臨床試驗(yàn)的前夜，將有可能徹底解決供體短缺難題。當(dāng)然，豬與靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物之間還存在急性免疫排斥、凝血功能障礙和種間交叉感染等難題，但相信隨著生物工程技術(shù)的發(fā)展，異種肝移植終將突破這些障礙，真正走向臨床應(yīng)用，為人類(lèi)健康做出巨大的貢獻(xiàn)。