碳青霉烯類(lèi)耐藥肺炎克雷伯菌的分子特征

高倩倩， 殷 杏， ?？∮ⅲ?秦娟秀， 黃 芊， 夏 強(qiáng)， 李 敏

肺炎克雷伯菌是臨床上常見(jiàn)的條件致病菌，可引起呼吸道、泌尿道、腸道、血液及其他無(wú)菌部位（如腹腔、胸腔、關(guān)節(jié)等）的多部位感染[1]。碳青霉烯類(lèi)抗生素是目前臨床上治療產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酰胺酶（ESBL）腸桿菌科細(xì)菌感染的首選藥物，然而隨著臨床的廣泛使用，碳青霉烯類(lèi)耐藥肺炎克雷伯菌（CRKP）的比例逐年上升[2]，產(chǎn)碳青霉烯酶是其耐藥及廣泛傳播的主要原因之一，并有研究報(bào)道已出現(xiàn)高毒力高耐藥菌株[3-4]。如果這類(lèi)菌株廣泛出現(xiàn)并傳播，會(huì)造成嚴(yán)重的難治性感染。本課題旨在研究CRKP常見(jiàn)碳青霉烯類(lèi)耐藥基因與毒力基因的分布及分子流行病學(xué)特征。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源

收集2015年上海仁濟(jì)醫(yī)院和長(zhǎng)征醫(yī)院臨床分離84株非重復(fù)CRKP，其中54株來(lái)自上海仁濟(jì)醫(yī)院，30株來(lái)自長(zhǎng)征醫(yī)院。

1.2 儀器和試劑

藥敏紙片（英國(guó)OXOID公司），血瓊脂培養(yǎng)基、MH瓊脂培養(yǎng)基（法國(guó)生物梅里埃公司），聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增以及純化試劑盒（日本TaKaRa公司），PCR擴(kuò)增儀（Eppendorf公司），VITEK 2-Compact全自動(dòng)微生物鑒定藥敏試驗(yàn)分析儀（法國(guó)生物梅里埃公司），基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MF， Microflex LT/Sh，BRUKER，德國(guó)）。

1.3 菌株鑒定及藥敏試驗(yàn)

全部菌株使用VITEK 2 -Compact全自動(dòng)微生物鑒定儀鑒定為肺炎克雷伯菌，并經(jīng)MALDI-TOFMF儀驗(yàn)證。藥物的敏感性通過(guò)紙片擴(kuò)散法檢測(cè)，檢測(cè)藥物有：阿米卡星、頭孢他啶、慶大霉素、氨芐西林、環(huán)丙沙星、哌拉西林、氨芐西林-舒巴坦、頭孢吡肟、頭孢呋辛鈉、頭孢哌酮-舒巴坦、頭孢噻肟、頭孢唑林、厄他培南、美羅培南、亞胺培南15種抗菌藥物。大腸埃希菌ATCC 25922為藥敏試驗(yàn)質(zhì)控菌株。

1.4 多位點(diǎn)序列分型（MLST）

個(gè)管家基因：rpoB、gapA、mdh、pgi、infB、tonB、infB并測(cè)序，引物參見(jiàn)網(wǎng)站：（http：//bigsdb.web.pasyeur.fr/klebsiella/Klebsiella.html），測(cè)序結(jié)果提交MLST網(wǎng)站（http：//www.pasteur.fr/recherche/Genopole/PF8/mlst/Kpneumoniae.html）進(jìn)行序列比對(duì)。

1.5 高黏液表型（HM）檢測(cè)

應(yīng)用黏液絲試驗(yàn)檢測(cè)，用接種環(huán)輕觸血瓊脂平皿上培養(yǎng)過(guò)夜的新鮮菌落向外牽拉，重復(fù)牽拉2次，若2次均有黏液絲形成并且長(zhǎng)度大于5 mm即判為HM表型陽(yáng)性，即該菌株為HM菌株[5]。

1.6 耐藥基因及毒力基因檢測(cè)

煮沸法制備模板，PCR擴(kuò)增耐藥基因blaKPC-2、blaNDM、blaVIM、blaOXA、blaIMP及毒力基因rmpA、mrkD、entB、ybtS、magA、iutA、allS、kfu并由上海鉑尚生物有限公司完成雙向測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI上比對(duì)（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），引物序列及擴(kuò)增條件參考文獻(xiàn)[3, 6]。

1.7eBUEST軟件分析親緣關(guān)系

據(jù)使用eBURST軟件（Version3，http：//eburst.mlst.net/）進(jìn)行親緣關(guān)系分析。7個(gè)位點(diǎn)中6個(gè)相同定義為一組，即為克隆群，構(gòu)建進(jìn)化關(guān)系圖譜。1個(gè)分型組中包含4個(gè)或4個(gè)以上ST型的定義為1個(gè)克隆復(fù)合體CC。每個(gè)克隆復(fù)合體中有1個(gè)經(jīng)計(jì)算推測(cè)認(rèn)為是起源的ST型，即為群主，該克隆復(fù)合體中的其他ST型是在起源的ST型基礎(chǔ)上進(jìn)化而來(lái)的。與起源的ST型相比，有1個(gè)管家基因編碼不同的ST型稱為單個(gè)位點(diǎn)變異型（SLV），有2個(gè)管家基因編碼不同的ST型稱為雙位點(diǎn)變異型（DLV），不屬于任何一個(gè)克隆復(fù)合體的ST型稱為單個(gè)型。

1.8 統(tǒng)計(jì)方法

應(yīng)用WHONET5.6軟件對(duì)藥敏試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，折點(diǎn)解讀參考美國(guó)CLSI 2016標(biāo)準(zhǔn)，F(xiàn)isher確切概率法，比較不同克隆型毒力基因及耐藥基因的攜帶率；判斷不同克隆型耐藥差異，P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 菌株分布

收集2015年CRKP共84株。多來(lái)源于呼吸道標(biāo)本（58.3%，49/84，包括痰、肺泡灌洗液），其次是無(wú)菌體液（17.9%，15/84），血（13.1%，11/84）和皮膚軟組織（6.0%，5/84）及尿（4.8%，4/84）。菌株最多檢出于ICU（31.0%，26/84），其次為外科（29.8%，25/84），干部病房（17.9%，15/84），內(nèi)科（13.1%，11/84），門(mén)急診和骨科分別檢出5株和2株。

2.2MLST分析結(jié)果

84株CRKP分為8個(gè)不同ST型，其中主要的流行菌株是ST11（84.5%，71株），其余為ST15（4株）、ST323（4株）、ST1869（1株）、 ST722（1株）、 ST1647（1株）、 ST709（1株）、ST45（1株）。侵襲性感染（無(wú)菌體液和血液）的26株菌中ST11有25株（占96.2%），非侵襲性感染菌株中ST11型占79.3%（46/58），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。4株ST323有1株為侵襲性感染，而4株ST15均為非侵襲性感染。

2.3 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

84株CRKP對(duì)亞胺培南、美羅培南及厄他培南耐藥率均為100%，對(duì)環(huán)丙沙星和阿米卡星耐藥率分別為77.4%和82.1%，對(duì)頭孢菌素類(lèi)、氨基糖苷類(lèi)、青霉素類(lèi)耐藥率均超過(guò)90%。不同ST型耐藥率見(jiàn)表1。

表1 84株CRKP對(duì)15種抗菌藥物的耐藥情況Table 1 Resistant rates of 84 strains of carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae to antimicrobial agents[n ( % ) ]

2.4 碳青霉烯酶耐藥基因分布

PCR及測(cè)序結(jié)果顯示84株CRKP中78株攜帶碳青霉烯酶耐藥基因，其中不同ST型耐藥基因分布見(jiàn)表2。

表2 不同ST型CRKP耐藥基因分布情況Table 2 Prevalence of antimicrobial resistance gene in carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae strains in terms of ST types[n ( % ) ]

2.5HM表型檢測(cè)及毒力基因分布

84株CRKP中，黏液絲試驗(yàn)顯示2株HM 表型， MLST分型均為ST11，且攜帶有mrkD、entB、ybtS、rmpA和ituA毒力基因。不同ST型攜帶毒力基因見(jiàn)表3。

2.6eBURST軟件分析種群結(jié)構(gòu)

將本研究的數(shù)據(jù)結(jié)合PubMLST數(shù)據(jù)庫(kù)中已有的肺炎克雷伯菌序列型進(jìn)行eBURST分析。84株CRKP分為8個(gè)ST型，2個(gè)ST群。每個(gè)ST群分別包括2個(gè)ST型（ST11和ST1869，ST15和ST709）。其他4個(gè)ST型都是單個(gè)ST型。84株ST型菌株再與MLST數(shù)據(jù)庫(kù)中相關(guān)的500株肺炎克雷伯菌比較，后者分為37個(gè)克隆群，其中有16個(gè)克隆群有其相應(yīng)的群主（CC258、CC292、CC65、CC17、CC163、CC15、CC37、CC29、CC133、CC273、CC131、CC347、CC42、CC91、CC34、CC76），本實(shí)驗(yàn)71株ST11、4株ST15、4株ST323和1株ST45分別屬于CC258、CC15、CC163克隆復(fù)合體。見(jiàn)圖1。

表3 不同ST型CRKP毒力基因分布情況Table 3 Prevalence of virulence genes in carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae strains in terms of ST types[n ( % ) ]

圖1 MLST數(shù)據(jù)庫(kù)種群快照?qǐng)DFigure 1 Population snapshot in multi locus sequence typing database

3 討 論

肺炎克雷伯菌是臨床上常見(jiàn)的條件致病菌，CRKP的出現(xiàn)與播散是世界性的共同難題[1-2，7]。近年不斷有報(bào)道發(fā)現(xiàn)了高耐藥高毒力的肺炎克雷伯菌[3-4，8]，該種菌株的出現(xiàn)給患者的生命造成了極大威脅。本研究針對(duì)耐藥基因與毒力基因的攜帶情況及分子流行病學(xué)特征展開(kāi)深入研究，以明確表型和基因特征。

本研究發(fā)現(xiàn)CRKP除對(duì)環(huán)丙沙星及阿米卡星的耐藥率為77.4%和82.1%外，對(duì)其他臨床常用多種藥物高度耐藥，包括青霉素類(lèi)、頭孢菌素類(lèi)、碳青霉烯類(lèi)及氨基糖苷類(lèi)等，耐藥率均在90%以上，使CRKP感染患者面臨無(wú)藥可治的風(fēng)險(xiǎn)。產(chǎn)碳青霉烯酶是肺炎克雷伯菌對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗生素耐藥的機(jī)制之一，目前最受關(guān)注的是Ambler A組的KPC-2型碳青霉烯酶，因其通常由質(zhì)粒介導(dǎo)，且能在不同病原菌尤其是腸桿菌科細(xì)菌中表達(dá)，故其流行范圍最廣[9-10]。本研究耐藥基因檢測(cè)結(jié)果顯示，90.5%攜帶blaKPC-2基因，1.2%分別攜帶blaNDM、blaIMP，僅1株CRKP同時(shí)攜帶blaKPC-2和blaNDM，這與其他報(bào)道相比較低[11-12]。另外本實(shí)驗(yàn)中有6株未檢測(cè)出碳青霉烯酶基因，其耐藥機(jī)制可能與膜通透性改變或外排泵有關(guān)，同時(shí)這也提示肺炎克雷伯菌的耐藥表型受多種耐藥機(jī)制的影響[6]。根據(jù)不同克隆型耐藥基因的分布可知，其中98.6%的ST11攜帶有blaKPC-2，提示產(chǎn)KPC酶是這2所醫(yī)院CRKP的主要耐藥機(jī)制。

84株CRKP的毒力基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)mrkD、entB、ybtS攜帶率較高，達(dá)90%以上，其他毒力基因攜帶率較低。其中mrkD編碼黏附性菌毛的黏附作用是致病的先決條件，本研究中僅檢出2株mrkD陰性CRKP。entB、ybtS同屬于鐵載體系統(tǒng)，其具有雙重作用，一方面能抑制T細(xì)胞增值，另一方面可以攝取鐵，均被認(rèn)為與肺炎克雷伯菌的毒力相關(guān)。此外，本研究還檢出2株HM型菌株，其毒力基因檢出率要明顯高于其他非黏液型菌株，建議實(shí)驗(yàn)室除了開(kāi)展對(duì)肺炎克雷伯菌的耐藥性檢測(cè)外，還應(yīng)該留意檢測(cè)肺炎克雷伯菌的黏液表型，并及時(shí)與臨床溝通。

84株CRKP進(jìn)行MLST分型，eBURST分析分為8個(gè)ST型，親緣關(guān)系較近的有ST11和ST1869，ST15和ST709，其中84.5%的菌株為ST11，是本次研究的主要ST型，與本地區(qū)之前的報(bào)道相比，主要ST型并沒(méi)有發(fā)生改變[13]。本研究也發(fā)現(xiàn)ST15和ST323在小范圍內(nèi)有一定的傳播，提示耐藥菌株具有多樣性的特點(diǎn)。分子流行病學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)KPC酶的肺炎克雷伯菌主要是ST11和ST15，兩者blaKPC-2陽(yáng)性率之和達(dá)97.2%，主要分布在ICU及神經(jīng)外科等感染多發(fā)科室。

綜上所述，上海2所醫(yī)院主要流行的CRKP克隆株是ST11，CRKP對(duì)大多數(shù)臨床常用抗菌藥物高度耐藥，其主要的耐藥機(jī)制是產(chǎn)KPC酶，并呈現(xiàn)出克隆傳播趨勢(shì)。在84株CRKP中出現(xiàn)2株高毒力克隆株，醫(yī)院相關(guān)部門(mén)應(yīng)對(duì)耐碳青霉烯類(lèi)肺炎克雷伯菌開(kāi)展更廣范圍的監(jiān)測(cè)，積極控制CRKP的流行傳播，尤其控制高毒力高耐藥菌株的傳播，同時(shí)醫(yī)護(hù)人員應(yīng)遵循規(guī)范化操作，盡量避免由醫(yī)護(hù)人員導(dǎo)致的傳播，臨床醫(yī)師在抗感染治療時(shí)，應(yīng)綜合各方面考慮，合理和聯(lián)合用藥，盡量減輕抗生素對(duì)細(xì)菌的選擇壓力。

[1]TANGDEN T， GISKE CG. Global dissemination of extensively drug-resistant carbapenemase-producing Enterobacteriaceae：clinical perspectives on detection， treatment and infection control[J]. J Intern Med， 2015， 277（5）： 501-512.

[2]PRESTINACI F， PEZZOTTI P， PANTOSTI A，et al.Antimicrobial resistance： a global multifaceted phenomenon[J].Pathog Glob Health， 2015， 109（7）： 309-318.

[3]ZHANG Y， ZENG J， LIU W， et al. Emergence of a hypervirulent carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae isolate from clinical infections in China[J]. J Infect， 2015， 71（5）： 553-560.

[4]ZHANG R， LIN D， CHAN EW， et al. Emergence of carbapenem-resistant serotype K1 hypervirulent Klebsiella pneumoniae strains in China[J]. Antimicrob Agents Chemother，2015， 60（1）： 709-711.

[5]NADASY KA， DOMIATI-SAAD R， TIBBLE MA，et al.Invasive Klebsiella pneumoniae syndrome in North America[J].Clin Infect Dis， 2007， 45（3）： e25-e28.

[6]KACZMAREK FM， DIB-HAJJF， SHANG W， et al. Highlevel carbapenem resistance in a Klebsiella pneumoniae clinical isolate is due to the combination of bla（ACT-1） beta-lactamase production， porin OmpK35/36 insertional inactivation， and down-regulation of the phosphate transport porin phoe[J].Antimicrob Agents Chemother， 2006， 50（10）： 3396-3406.

[7]MUNOZ-PRICE LS， POIREL L， BONOMO RA， et al. Clinical epidemiology of the global expansion of Klebsiella pneumoniae carbapenemases[J]. Lancet Infect Dis， 2013， 13（9）：785-796.

[8]SURGERS L， BOYD A， GIRARD PM，et al. ESBL-producing strain of hypervirulent Klebsiella pneumoniae K2， France[J].Emerg Infect Dis， 2016， 22（9）：1687-1688.

[9]NORDMANN P， CUZON G， NAAS T. The real threat of Klebsiella pneumoniae carbapenemase-producing bacteria[J].Lancet Infect Dis，2009， 9（4）：228-236.

[10]PAPP-WALLACE KM， BETHEL CR，DISTLER AM， et al.Inhibitor resistance in the KPC-2 beta-lactamase， a preeminent property of this class A beta-lactamase[J]. Antimicrob Agents Chemother， 2010， 54（2）：890-897.

[11]KHANAU， MARYAM L， ZARRILLI R. Structure， genetics and worldwide spread of New Delhi metallo-beta-lactamase（NDM）： a threat to public health[J]. BMC Microbiol， 2017，17（1）：101.

[12]李天驕，王旭明，符生苗，等. 海南發(fā)現(xiàn)4株產(chǎn)NDM-1多重耐藥的肺炎克雷伯菌[J]. 中國(guó)熱帶醫(yī)學(xué)， 2013，13（12）：1468-1471.

[13]QI Y， WEI Z， JI S， et al. ST11， the dominant clone of KPC-producing Klebsiella pneumoniae in China[J]. J Antimicrob Chemother， 2011， 66（2）：307-312.