胰腺導(dǎo)管腺癌中腺苷酸激酶4的表達(dá)及臨床意義

李辰運(yùn)，孫彤，卓娜，田晶

（天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院超聲科，天津300211）

胰腺癌是消化道惡性腫瘤中惡性程度最高、預(yù)后最差的惡性腫瘤之一，已經(jīng)取代肝癌成為新的癌中之王。胰腺癌起病隱匿，發(fā)展較快，易發(fā)生轉(zhuǎn)移，手術(shù)切除率低，預(yù)后極差，5年生存率不足5%[1-4]。而突破診治胰腺癌的關(guān)鍵在于：立足基礎(chǔ)研究，深入理解胰腺癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，從而尋找有效的診治手段。胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)極其復(fù)雜的過(guò)程，是多種因素共同作用的結(jié)果。85%以上的胰腺癌來(lái)源于胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞，因此研究導(dǎo)管腺癌對(duì)胰腺癌的診療意義較大。胰腺癌的發(fā)病率近年來(lái)呈上升趨勢(shì)，2017年美國(guó)將會(huì)有53 670例新發(fā)病患，死亡人數(shù)將達(dá)到43 090人[1]。作為唯一可治愈胰腺癌的方法，根治性手術(shù)切除的機(jī)會(huì)在胰腺癌病患中的比例很低[2]。嗜神經(jīng)浸潤(rùn)是胰腺癌生物學(xué)特性之一，與其不良預(yù)后有關(guān)[3]。本研究通過(guò)回顧性分析接受胰腺癌根治手術(shù)治療的76例胰腺導(dǎo)管腺癌患者的臨床病理特點(diǎn)與隨訪(fǎng)資料，以免疫組織化學(xué)的方法檢測(cè)胰腺導(dǎo)管腺癌組織中腺苷酸激酶4（adenylate kinase 4,AK4）蛋白的表達(dá)，探討AK4蛋白在胰腺導(dǎo)管腺癌組織中的表達(dá)及臨床意義，進(jìn)而為胰腺癌患者的靶向治療提供理論依據(jù)。

1 資料和方法

1．1 臨床資料 收集2012年1月-2016年7月期間天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院76例胰腺導(dǎo)管腺癌患者手術(shù)切除的組織標(biāo)本，分析其臨床病理資料。患者均行根治性手術(shù)切除治療，全部病例均經(jīng)病理證實(shí)，術(shù)前未行化療或放療，具有完整的病例資料。收集患者的一般臨床資料，包括性別、年齡、腫瘤位置、腫瘤大小、手術(shù)方式、CA19-9、黃疸等。76例病例中男性45例，女性31例；年齡43～62歲，中位年齡（53．6±5．75）歲；腫瘤：≤2 cm 者 13 例，＞2 cm 者63例；組織學(xué)分化程度：中高分化腺癌34例，中低分化腺癌42例；腫瘤分期：Ⅰ期3例，Ⅱ期55例，Ⅲ期18例，本組入選無(wú)Ⅳ期病例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：陰性者57例，陽(yáng)性者19例；神經(jīng)受侵34例；脈管內(nèi)瘤栓者23例。

比較分析不同組患者的臨床病理學(xué)特征，包括：分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管受侵、脈管內(nèi)瘤栓、神經(jīng)受侵、腫瘤分期。腫瘤分期根據(jù)2010年第7版UICC和AJCC胰腺癌分期進(jìn)行TNM分期。隨訪(fǎng)：以電話(huà)和查閱病歷的方式隨訪(fǎng)。隨訪(fǎng)起始時(shí)間為手術(shù)時(shí)間，隨訪(fǎng)截止時(shí)間為2017年6月或患者死亡時(shí)間。統(tǒng)計(jì)學(xué)比較兩組患者一般臨床資料和臨床病理學(xué)資料及分析預(yù)后影響因素。

1．2 試劑 AK4為兔抗人單克隆抗體，購(gòu)自武漢愛(ài)博泰克生物科技有限公司（Catalog No:A2050），稀釋濃度為1∶200，免疫組化二步法檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司（pv6002，通用型二抗）。

1．3 方法 胰腺導(dǎo)管腺癌組織進(jìn)行福爾馬林固定，石蠟包埋，標(biāo)本進(jìn)行5 μm切片，行AK4免疫組化染色。免疫組織化學(xué)采用SP二步法，DAB顯色。染色切片于顯微鏡高倍鏡下 (400倍)隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)視野，計(jì)數(shù)100個(gè)腫瘤細(xì)胞，根據(jù)腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性染色百分率和染色強(qiáng)度綜合評(píng)價(jià)免疫組化結(jié)果。1．4 免疫組化染色結(jié)果的判定 AK4蛋白表達(dá)主要定位于腫瘤細(xì)胞的胞漿,也有不同程度的胞核著色，呈棕黃色顆粒狀。結(jié)果判定：陽(yáng)性細(xì)胞方面：陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞數(shù)＜10%記0分；腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性百分率為10%～30%記1分；腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性百分率為30%～70%記2分；腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性百分率＞70%記3分。同時(shí)對(duì)陽(yáng)性著色的腫瘤細(xì)胞的膜、漿染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)價(jià)：陰性記0分，弱陽(yáng)性記1分，中度陽(yáng)性記2分，強(qiáng)陽(yáng)性記3分；計(jì)分范圍為0～9分。實(shí)際結(jié)果根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞百分率分值和染色強(qiáng)度分值之積的分值判斷高表達(dá)（4～9分）或低表達(dá)（0～3分）。每個(gè)病例觀(guān)察5個(gè)高倍視野，在不知病理分級(jí)與臨床資料的情況下由兩位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)師讀片，釆用雙盲法判斷結(jié)果。

1．5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18．0軟件。兩組計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。生存率的計(jì)算采用Kaplan-meier法，生存曲線(xiàn)的比較采用Log-rank檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 AK4在胰腺導(dǎo)管腺癌組織中的表達(dá) 76例原發(fā)性胰腺導(dǎo)管腺癌組織中有60例（78．9%）AK4蛋白高表達(dá)，76例癌旁組織（距離腫瘤組織3～5 mm處的胰腺正常組織）中僅29例（38．2%）AK4呈高表達(dá)，免疫組織化學(xué)的染色結(jié)果分別見(jiàn)圖1和圖2。胰腺導(dǎo)管腺癌與癌旁組織陽(yáng)性率比較（χ2=26．051 7 2，P＜0．001），其表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 AK4在胰腺導(dǎo)管腺癌組織中的表達(dá)Fig 1 Expression of AK4 in pancreatic ductal carcinoma tissues

圖2 AK4在胰腺導(dǎo)管腺癌癌旁組織中的表達(dá)Fig 2 Expression of AK4 in pancreatic tissues adjacent to ductal carcinoma

2．2 胰腺導(dǎo)管腺癌組織AK4的表達(dá)與臨床病理特征和預(yù)后的相關(guān)性 如表1所示，AK4的異常表達(dá)與胰腺導(dǎo)管腺癌分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、神經(jīng)受侵、脈管內(nèi)瘤栓相關(guān)（P＜0．05），與患者的性別、年齡、分化程度、腫瘤大小無(wú)關(guān)。圖3示患者預(yù)后生存分析結(jié)果，AK4 均與患者預(yù)后明顯相關(guān)（P＜0．05）：AK4 高表達(dá)的胰腺導(dǎo)管腺癌患者術(shù)后中位生存期明顯短于A(yíng)K4低表達(dá)的胰腺導(dǎo)管腺癌患者[（12．20±0．870）個(gè)月 vs(18．30±4．168）個(gè)月]。

表1 76例胰腺導(dǎo)管腺癌AK4表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系Tab 1 The relationships between AK4 expression and clinicopathologic features in pancreatic ductal carcinoma

圖3 AK4與胰腺導(dǎo)管腺癌患者術(shù)后預(yù)后相關(guān)性分析Fig 3 Analysis of correlation between AK4 expression and postoperativeprognosisofpatientswithpancreatic ductal carcinoma

3 討論

腺苷酸激酶是多種生物活細(xì)胞中高能量磷酸化轉(zhuǎn)移反應(yīng)中的一種關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶，在腺嘌呤核苷酸代謝和體內(nèi)穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用，通過(guò)催化互變現(xiàn)象反應(yīng):ATP+AMP?2 ADP。目前，研究報(bào)道的AK共有9種，為AK1-9，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)AK5、AK7、AK8和AK9定位在細(xì)胞質(zhì)中，而AK6和AK9定位表達(dá)在細(xì)胞核中，AK2定位在線(xiàn)粒體中膜間空間，而線(xiàn)粒體基質(zhì)中則存在著AK3和AK4。AK1的缺乏會(huì)導(dǎo)致血液病[5]，AK2對(duì)D黑色素的生長(zhǎng)至關(guān)重要，而遺傳的AK2缺乏會(huì)導(dǎo)致網(wǎng)狀的發(fā)育障礙和神經(jīng)性耳聾[6-7]。到目前為止，多項(xiàng)研究已報(bào)道了AK的結(jié)構(gòu)和功能，并報(bào)告說(shuō)它們?cè)诩?xì)胞能量代謝中起著重要作用[8-12]。而其中的AK4在線(xiàn)粒體基質(zhì)中被定位并被認(rèn)為是參與滲透壓、耐藥、惡性腫瘤轉(zhuǎn)化和ATP調(diào)節(jié)的一種關(guān)鍵酶。早期有文獻(xiàn)報(bào)道了鐵的螯合劑去鐵胺用于治療肝細(xì)胞癌，發(fā)現(xiàn)去鐵胺能提高AK4的表達(dá)水平，但具體機(jī)制不明確[13]。既往文獻(xiàn)報(bào)道已經(jīng)克隆了編碼人類(lèi)和小鼠AK4基因cDNAs[12，14]，并且AK4的表達(dá)式模式已廣泛應(yīng)用于小鼠組織中[9]，但是，即使在線(xiàn)粒體基質(zhì)中檢測(cè)到了AK4，AK4卻沒(méi)有顯示任何酶活性。隨后有文獻(xiàn)報(bào)道，未激活的AK4與線(xiàn)粒體內(nèi)膜蛋白ANT相互作用[15]。與此相反，另一項(xiàng)研究證實(shí)AK4的激活是需要應(yīng)用AMP:GTP和AMP:ATP作為其底物的[16]。因此，AK4是否顯示了經(jīng)典的酶活性目前還是存在爭(zhēng)議的。另一項(xiàng)功能研究表明，AK4可能參與氧化應(yīng)激反應(yīng)，顯示它是由4種不同類(lèi)型的藥物，包括四氯化碳等肝毒性的藥物所控制的一種蛋白質(zhì)[17-18]。有趣的是，一項(xiàng)單中心研究發(fā)現(xiàn)，AK4能促進(jìn)肺癌的惡性進(jìn)展[19]。此外，據(jù)報(bào)道，在腎胚細(xì)胞HEK293和肝細(xì)胞中AK4是一個(gè)有價(jià)值的標(biāo)記物[20]。最近，Lanning等[21]發(fā)現(xiàn)AK4是細(xì)胞內(nèi)ATP水平的關(guān)鍵調(diào)節(jié)器，通過(guò)篩選RNA干擾（RNAi）庫(kù)，目標(biāo)是超過(guò)1 000個(gè)核dna編碼的基因，這些基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物局限于線(xiàn)粒體。

然而，AK4功能的分子基礎(chǔ)仍有待確定。2016年的一篇較為權(quán)威的文獻(xiàn)利用AK4小干擾RNA（siRNA），在HeLa細(xì)胞中結(jié)合核糖核酸（shRNA）質(zhì)粒，進(jìn)而降低AK4表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)AK4降表達(dá)后能提高ATP產(chǎn)量、抑制腫瘤細(xì)胞增殖、提高抗癌藥物的敏感性等，并進(jìn)一步在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中證實(shí)了這些結(jié)論；同時(shí)，在代謝組學(xué)分析方面，證實(shí)AK4降表達(dá)后增加了諸如富馬酸酯和蘋(píng)果酸鹽等在內(nèi)的三羧酸循環(huán)中間產(chǎn)物，而AK4過(guò)度表達(dá)則能降低它們的表達(dá)水平；電子顯微鏡檢測(cè)到AK4降表達(dá)的細(xì)胞中線(xiàn)粒體數(shù)目的增加；在基因組學(xué)研究中，利用微陣列分析檢測(cè)TCA循環(huán)中兩種關(guān)鍵酶的基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)琥珀酸脫氫酶A（SDHA）和oxoglutarate脫氫酶L（OGDHL）的水平增加[22]。這些發(fā)現(xiàn)為針對(duì)AK4進(jìn)行有效的抗癌療法奠定了分子生物學(xué)的理論基礎(chǔ)。

目前，經(jīng)過(guò)文獻(xiàn)檢索，關(guān)于A(yíng)K4的相關(guān)報(bào)道國(guó)內(nèi)僅有兩篇文獻(xiàn)，均證實(shí)AK4是一種細(xì)胞壓力反應(yīng)蛋白，均能對(duì)細(xì)胞進(jìn)行低氧應(yīng)激保護(hù)，還都發(fā)現(xiàn)AK4表達(dá)升高能促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)及發(fā)育[23-24]。在機(jī)制上進(jìn)行分析研究發(fā)現(xiàn)，利用AK4-FLAG的相互結(jié)合和相互作用，通過(guò)對(duì)這種復(fù)合物的免疫共沉淀及質(zhì)譜分析，明確了線(xiàn)粒體內(nèi)膜蛋白ANT與AK4的互相影響，而后又進(jìn)一步通過(guò)反向的免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)得出了可靠的結(jié)論，即證實(shí)了AK4與ANT的相互作用和機(jī)制[23-24]。

本項(xiàng)研究表明AK4在胰腺導(dǎo)管腺癌中的異常表達(dá)與胰腺癌分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、神經(jīng)受侵和脈管內(nèi)瘤栓相關(guān)，并且其表達(dá)與患者預(yù)后明顯相關(guān)。這可能揭示在胰腺導(dǎo)管腺癌組織中AK4通過(guò)相應(yīng)機(jī)制參與胰腺導(dǎo)管腺癌的發(fā)生發(fā)展，產(chǎn)生了一系列的生物學(xué)效應(yīng)，可能與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、神經(jīng)受侵、脈管內(nèi)瘤栓等密切相關(guān)，促進(jìn)胰腺導(dǎo)管腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移，進(jìn)而導(dǎo)致患者預(yù)后不良。

胰腺導(dǎo)管腺癌早期癥狀不典型、不特異[13]，其惡性程度很高，與其具有嗜神經(jīng)生長(zhǎng)的生物學(xué)特性有關(guān)。結(jié)合我們的結(jié)果可以表明，在胰腺導(dǎo)管腺癌組織中AK4基因的激活，可能通過(guò)一定的調(diào)控機(jī)制而促進(jìn)胰腺癌的神經(jīng)浸潤(rùn)。由此可見(jiàn)，胰腺導(dǎo)管腺癌中AK4是一個(gè)重要的調(diào)節(jié)因素，隨著對(duì)其作用機(jī)制的深入研究，可能會(huì)成為胰腺導(dǎo)管腺癌治療的一個(gè)新靶點(diǎn)。

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