王子喬,張雪茜,孟凡榮,劉 喆
(天津醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院,天津300070)
肺癌占全世界腫瘤發(fā)病率的12.7%、死亡率的18.2%,是目前最常見的引發(fā)死亡的疾病之一[1]。在臨床和組織病理學(xué)上,肺癌分為兩大類,小細(xì)胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)和非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)。小細(xì)胞肺癌大約占肺癌的20%,而更具有腫瘤異質(zhì)性的非小細(xì)胞肺癌大約占80%[2]。小細(xì)胞肺癌與非小細(xì)胞肺癌相比惡性程度較高,轉(zhuǎn)移早而廣泛,盡管小細(xì)胞肺癌對化療、放療敏感,但很快出現(xiàn)復(fù)發(fā)或病情進(jìn)展[3],目前尚無有效的靶向治療藥物,因此小細(xì)胞肺癌是研究腫瘤轉(zhuǎn)移很好的模型。由于人小細(xì)胞肺癌中腫瘤抑制基因Trp53和Rb1的高突變率,所以Trp53和Rb1基因的缺失可能為建立小鼠小細(xì)胞肺癌模型提供了合理的手段[4],我們利用Cre-loxP系統(tǒng)來特異性敲除Trp53loxP/loxP;Rb1loxP/loxP小鼠肺上皮細(xì)胞中Rb1和Trp53,其Ad-Cre重組腺病毒是通過氣管插管來感染小鼠。因此體內(nèi)氣道上皮和肺泡Ⅱ型細(xì)胞中敲除Rb1和Trp53,誘發(fā)小鼠的小細(xì)胞肺癌。
1.1 材料 Trp53loxP/loxP;Rb1loxP/loxP小鼠由中科院上海生化細(xì)胞研究所季紅斌教授饋贈,所用腺病毒Ad-Cre來自 VECTOR BIOLABS(The Gene Delivery Company,貨號 1045)。
1.2 試劑 PCR試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。DAB顯色試劑購自北京中杉金橋。CgA抗體購自美國ABcam公司(貨號ab15160)。Cgrp抗體購自Milipore(貨號AB5920)。TTF-1抗體購自邁新試劑(貨號MAB-0599)。小鼠麻醉劑購自美國Sigma公司(貨號T48402)。
1.3 小鼠的鑒定 Trp53基因型鑒定引物:5′-CGCAATCCTTTATTCTGTTCG-3′,5′-AGCACATAG GAGGCAGAGAC-3′,5′-TGAGACAGGGTCTTGCTA TTG-3′。Rb1 基因型鑒定引物:5′-GAAAGGAAAGT CAGGGACATTGGG-3′,5′-GGCGTGTGCCATCAA TG-3′。
1.4 小鼠小細(xì)胞肺癌動(dòng)物模型的建立 首先腹腔注射麻醉劑麻醉2月齡小鼠,再以Ad-CreCaPi(Ad-Cre CaPi:滴度為107PfU的Ad-Cre2μL加入到246.8μL的MEM中,再加入1.2μL的2mol/LCaCl2)的共沉淀物插管吸入小鼠氣管,每只小鼠吸入約100μL。病毒誘導(dǎo)7個(gè)月后收集死亡小鼠的肺、肝等組織進(jìn)行石蠟包埋、切片、HE染色以及相關(guān)病理分析。
1.5 免疫組化檢測 通過對小鼠肺組織切片進(jìn)行TTF-1、CgA、Cgrp等特異性標(biāo)記蛋白的免疫組化染色,可確定腫瘤細(xì)胞是否表達(dá) TTF-1、CgA、Cgrp,從而確定是否為小細(xì)胞肺癌。
2.1 小鼠的鑒定 取小鼠尾部組織消化并提取基因組DNA,以基因組DNA為模板進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),擴(kuò)增得到Trp53loxP/loxP和WT對照小鼠的產(chǎn)物以及Rb1loxP/loxP和WT對照小鼠的產(chǎn)物,鑒定產(chǎn)物見圖1。
圖1 小鼠基因型鑒定Fig 1 PCR result of mouse genome DNA
2.2 小鼠小細(xì)胞肺癌模型的建立 17只Trp53loxP/loxP;Rb1loxP/loxP小鼠成功給予Ad-Cre病毒,病毒處理后小鼠質(zhì)量逐漸降低,最終有11只(65%)小鼠造模成功。約7個(gè)月后,小鼠開始死亡,解剖死亡小鼠后肺部可觀察到大量結(jié)節(jié),暗示肺部腫瘤的形成是小鼠致死的主要原因。肺癌發(fā)生小鼠肺部表型見圖2。
圖2 小鼠肺部形成結(jié)節(jié)(黑色箭頭所示為結(jié)節(jié))Fig 2 Pulmonary nodules in mouse lung(Black arrow indicates pulmonary nodules)
2.3 小鼠肺組織切片病理染色 收集小鼠肺組織石蠟切片并進(jìn)行HE染色,發(fā)現(xiàn)肺部有大量腫瘤灶的形成,且腫瘤細(xì)胞較小,擠壓變形,核漿比增大,呈現(xiàn)明顯的小細(xì)胞肺癌的特性。小鼠肺部切片HE染色結(jié)果見圖3。
A.小鼠肺組織HE染色顯示腫瘤形成;B.A圖區(qū)域放大。標(biāo)尺:100μm圖3 小鼠肺組織切片HE染色Fig 3 Representative HE stain of lungs from mice
2.4 小鼠肺組織切片免疫組化染色 將上述腫瘤組織切片分別進(jìn)行TTF-1、CgA、Cgrp免疫組化染色(圖4),發(fā)現(xiàn)在肺部腫瘤灶中TTF-1、CgA、Cgrp的表達(dá)水平顯著升高,大部分腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)TTF-1、CgA陽性以及Cgrp陽性,說明小鼠肺部腫瘤為小細(xì)胞肺癌。
圖4 小鼠肺組織TTF-1、CgA、Cgrp免疫組化染色Fig 4 IHCstainingwithanti-TTF-1,anti-CgA,anti-Cgrpperformed on lung tissues
2.5 小鼠小細(xì)胞肺癌模型的肝轉(zhuǎn)移 對死亡小鼠進(jìn)行解剖分析,發(fā)現(xiàn)小鼠的肝組織上出現(xiàn)大量結(jié)節(jié)(圖5),通過石蠟切片及病理染色,肝組織中腫瘤細(xì)胞形態(tài)與肺部腫瘤細(xì)胞病理染色結(jié)果相似,說明小鼠肺部小細(xì)胞肺癌發(fā)生了肝轉(zhuǎn)移。
圖5 小鼠小細(xì)胞肺癌的肝轉(zhuǎn)移Fig 5 Liver metastasis of small cell lung cancer in mice
肺癌是目前世界上致死率最高的主要疾病之一,它是一個(gè)龐大的疾病分類,包含了多種不同的表型以及遺傳突變,暗示著肺癌是一種高度異質(zhì)性的疾病[5]。因此肺癌被分為多個(gè)不同的類型,其中最廣泛應(yīng)用的分類是小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌。非小細(xì)胞肺癌是肺癌中最常見的一種,又可以分為腺癌、鱗癌和大細(xì)胞肺癌[6]。小細(xì)胞肺癌約占所有肺癌中的15%,具有神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞的特性[1]。根據(jù)2004年世界衛(wèi)生組織的分類,小細(xì)胞肺癌是神經(jīng)內(nèi)分泌型肺癌的一種,代表了侵襲能力最高的一類肺癌[7]。在近10年中,對小細(xì)胞肺癌的治療仍然沒有新的手段,5年的生存率仍保持在7%以下?;蚪M學(xué)分析發(fā)現(xiàn),在小細(xì)胞肺癌中存在多種重要基因突變,這些突變在小鼠小細(xì)胞肺癌模型中也得到了驗(yàn)證[5]。為了給小細(xì)胞肺癌的臨床診治提供新的依據(jù),加深對小細(xì)胞肺癌的起始、進(jìn)展、轉(zhuǎn)移和抗藥性的細(xì)胞以及分子機(jī)制的理解顯得至關(guān)重要,但是到目前為止,仍然缺乏小細(xì)胞肺癌的小鼠模型。
由于人小細(xì)胞肺癌中腫瘤抑制基因Trp53和Rb1的高突變率,所以Trp53和Rb1基因的缺失可能為建立一個(gè)小鼠小細(xì)胞肺癌模型提供了合理的手段[4]。根據(jù)已有的研究,在小鼠神經(jīng)內(nèi)分泌型腫瘤的形成過程中,單獨(dú)缺失Rb1或者Trp53并不會引起細(xì)胞凋亡[8],Rb1和Trp53是以一種協(xié)同作用的方式來發(fā)揮腫瘤抑制作用的,因此Rb1和Trp53的缺失是神經(jīng)內(nèi)分泌型腫瘤形成的先決條件[9]。
Trp53或Rb1缺失小鼠對于研究腫瘤進(jìn)程有相當(dāng)重要的價(jià)值,在小鼠肺組織中敲除Trp53會產(chǎn)生肺腺癌[10]。而Ad-Cre病毒誘導(dǎo)的Rb1在肺上皮中缺失直到第18個(gè)月都不會產(chǎn)生任何肺腫瘤,同時(shí)在這些小鼠中也不能檢測到神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞的異常增生。因此單獨(dú)的Rb1缺失并不足以誘導(dǎo)神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的形成,進(jìn)一步的腫瘤進(jìn)程可能還需要抑制Trp53介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[9]。根據(jù)已有的報(bào)道,Rb1與Trp53同時(shí)缺失會使得人肺腺癌更易向小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)化[11]。在本研究中,我們利用Trp53loxP/loxP;Rb1loxP/loxP小鼠,通過肺部氣管插管給予Ad-Cre重組腺病毒來誘導(dǎo)小鼠肺上皮細(xì)胞中Trp53以及Rb1的特異性缺失,從而建立了小鼠肺癌模型,并通過病理染色及TTF-1、CgA、Cgrp的免疫組化染色進(jìn)一步確定了該肺癌模型為小細(xì)胞肺癌模型。
對肝組織的病理分析發(fā)現(xiàn),小鼠肺組織的癌細(xì)胞已經(jīng)擴(kuò)散到肝臟等組織中,說明構(gòu)建的小鼠小細(xì)胞肺癌模型具有高度侵襲性,也進(jìn)一步證實(shí)了該小鼠小細(xì)胞肺癌模型[12]與人小細(xì)胞肺癌有高度的相似性,它也具有向其他功能器官,如腦、腎上腺、骨、卵巢轉(zhuǎn)移的潛能。該模型為研究小細(xì)胞肺癌的起始和早期提供了實(shí)驗(yàn)工具,為臨床上小細(xì)胞肺癌化療策略以及化療藥物的篩選提供了實(shí)驗(yàn)手段。
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