《血清中碘的測定 砷鈰催化分光光度法》標(biāo)準(zhǔn)解讀

申紅梅 紀(jì)曉紅 張亞平 賈清珍 王海燕 李衛(wèi)東 杜恣閑

《血清中碘的測定 砷鈰催化分光光度法》標(biāo)準(zhǔn)（WS/T 572-2017）已于2017年8月16號由中華人民共和國國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會發(fā)布，并將于2018年2月15號實(shí)施。本文主要圍繞標(biāo)準(zhǔn)的制定背景、主要技術(shù)內(nèi)容和制定依據(jù)進(jìn)行解讀。

1 標(biāo)準(zhǔn)制定的背景

隨著社會的進(jìn)步和經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人們對自身的健康越來越關(guān)注，包括個(gè)體的碘營養(yǎng)水平評價(jià)。狹義的碘營養(yǎng)評價(jià)指標(biāo)包括膳食碘攝入量、血清碘、甲狀腺含碘量、尿碘、乳汁碘；廣義的碘營養(yǎng)評價(jià)指標(biāo)還包括甲狀腺腫、甲狀腺功能、甲狀腺球蛋白、智商等[1]。血清碘代表體內(nèi)實(shí)際的碘水平，能比較真實(shí)地反映近期機(jī)體的碘營養(yǎng)狀況，且比較穩(wěn)定，近年來在個(gè)體碘營養(yǎng)評價(jià)指標(biāo)的篩選上受到越來越多的關(guān)注[2-4]，但是沒有統(tǒng)一的測定方法的標(biāo)準(zhǔn)，僅有在研究工作中應(yīng)用的方法報(bào)道，為了滿足個(gè)體碘營養(yǎng)評價(jià)的需求，急需建立標(biāo)準(zhǔn)的血清碘的測定方法。2015年經(jīng)國家衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)委員會地方病標(biāo)準(zhǔn)專業(yè)委員會工作會議同意立項(xiàng)，由國家衛(wèi)生計(jì)生委法制司批準(zhǔn)并列入2015年衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)制修訂項(xiàng)目計(jì)劃（項(xiàng)目編號20150401），中國疾病預(yù)防控制中心地方病控制中心、福建省廈門市疾病預(yù)防控制中心和山西省地方病防治研究所為標(biāo)準(zhǔn)起草單位，中國疾病預(yù)防控制中心營養(yǎng)與健康所、安徽省疾病預(yù)防控制中心和福建省龍巖市疾病預(yù)防控制中心作為標(biāo)準(zhǔn)驗(yàn)證單位。鑒于目前國際國內(nèi)尚無統(tǒng)一的血清碘測定方法標(biāo)準(zhǔn)，我們按照國家標(biāo)準(zhǔn)化工作的要求，充分考慮我國醫(yī)療衛(wèi)生體系實(shí)驗(yàn)室的設(shè)備設(shè)施，參考國內(nèi)外有關(guān)文獻(xiàn)，經(jīng)研究、改進(jìn)和驗(yàn)證后制定了本標(biāo)準(zhǔn)。

2 標(biāo)準(zhǔn)的主要技術(shù)內(nèi)容

2.1 原理

采用高氯酸-氯酸鈉溶液消化血清樣品，利用碘對砷鈰氧化還原反應(yīng)的催化作用：反應(yīng)中黃色的Ce4+被還原成無色的Ce3+，碘含量越高，反應(yīng)速度越快，所剩余的Ce4+則越少；控制反應(yīng)溫度和時(shí)間，比色測定體系中剩余Ce4+的吸光度值，求出碘含量。

2.2 儀器

（1）消化控溫加熱裝置：恒溫消解儀（控溫點(diǎn)精度 130℃±2℃，孔間溫差≤1℃）；（2） 恒溫水?。嚎販鼐取?.3℃；（3）分光光度計(jì)，1 cm 比色杯；（4）玻璃試管：15 mm×100 mm 或15 mm×120 mm；（5）定量移液器：100μl、1 000μl、5 000μl；定量玻璃移液管：5 ml和10 ml；（6） 秒表；（7）恒溫干燥箱；（8） 離心機(jī)。

2.3 試劑及配制的溶液

本標(biāo)準(zhǔn)所用試劑除另有說明外，均為分析純試劑，實(shí)驗(yàn)用水應(yīng)符合 GB/T 6682 中二級水規(guī)格。溶液配制過程中試劑應(yīng)符合標(biāo)準(zhǔn)要求，并且在配置過程中要嚴(yán)格控制碘污染。（1）氯酸鈉溶液[c（NaClO3）=2.0 mol/L]；（2）硫酸溶液 [c (H2SO4)=2.5 mol/L]；（3）亞砷酸溶液[c(H3AsO3)=0.025 mol/L]；（4）硫酸鈰銨溶液[c(Ce4+)=0.025 mol/L]；（5）碘標(biāo)準(zhǔn)溶液：①碘標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液[ρ(I)=100μg/ml]，②碘標(biāo)準(zhǔn)中間溶液 [ρ(I) =10 μg/ml]，③碘標(biāo)準(zhǔn)使用系列溶液[ρ(I)=0～300μg/L] 。

2.4 樣品采集和保存

使用一次性真空非抗凝采血管采集不少于2 ml血液，室溫靜置0.5 h后，于3 000 r/min離心10 min，分離出血清置于具塞聚乙烯塑料管中，嚴(yán)密封口以防水分蒸發(fā)。在室溫（20℃）下可保存7 d，在4℃下可保存1個(gè)月，密封后冷凍（-20℃）至少可保存3個(gè)月。注意：樣品在現(xiàn)場采集、運(yùn)輸和保存過程中應(yīng)避免與含碘物品接觸。

2.5 分析步驟

（1）分別取0.10 ml碘標(biāo)準(zhǔn)使用系列溶液及血清樣（如果血清樣的碘濃度超過標(biāo)準(zhǔn)曲線的碘濃度范圍，則用純水稀釋后取樣）各置于玻璃試管中，各管加入0.5 ml高氯酸、0.6 ml氯酸鈉溶液，混勻后置于130℃的消化控溫加熱裝置中，消化120 min，取下冷卻至室溫?？稍?5℃～30℃之間一個(gè)穩(wěn)定的溫度環(huán)境下（室溫或控溫）進(jìn)行以下（2）～（4）分析步驟，要求溫度波動(dòng)不超過±0.3℃。（2）各管加入3.0 ml亞砷酸溶液，充分混勻后放置15 min，使其溫度達(dá)到平衡（注意將標(biāo)準(zhǔn)系列管按碘濃度由高至低順序排列）。（3）秒表計(jì)時(shí)，依順序每管間隔相同的時(shí)間（30 s或20 s）向各管準(zhǔn)確加入0.60 ml硫酸鈰銨溶液，立即混勻。（4）待第一管（即標(biāo)準(zhǔn)系列中加300 mg/L碘濃度管）的吸光度值達(dá)到0.10左右時(shí)，依順序每管間隔同樣時(shí)間（與前一步驟間隔時(shí)間一致）于400 nm波長下，用1 cm比色杯，以純水作參比，測定各管的吸光度值。（5）標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：以碘濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值對數(shù)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.6 結(jié)果計(jì)算

以碘標(biāo)準(zhǔn)使用系列溶液的碘質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)和吸光度值對數(shù)為縱坐標(biāo)，在半對數(shù)坐標(biāo)系中繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以樣品管的吸光度值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得所測樣品的碘質(zhì)量濃度；稀釋的樣品再乘以稀釋倍數(shù)。

3 確定主要技術(shù)內(nèi)容的依據(jù)

3.1 預(yù)處理方法

碘樣品分析的預(yù)處理方法很多，主要可分為酸消化法、堿灰化法、微波密閉溶樣法、高溫水解法、低溫等離子體灰化法、氧瓶燃燒法等[5-6]。目前，氯酸法和溫和酸消化法在血清碘的測定中應(yīng)用較多[7-10]。溫和酸法消化血清需要用到硝酸，硝酸消化后的分解產(chǎn)物對下一步測定存在一定的干擾；溫和酸法、氯酸法測血清碘均需用到氯酸，但是氯酸配制過程較為復(fù)雜、易受到污染，如果不嚴(yán)格按照方法配制，氯酸濃度可能達(dá)不到要求，并且存放過程易分解，而且氯酸配制過程對于實(shí)驗(yàn)人員的健康有損害。

起草組根據(jù)以往工作經(jīng)驗(yàn)及查閱有關(guān)文獻(xiàn)，選出適合于消化各種樣品的相關(guān)試劑包括氯酸、溫和酸（硝酸+氯酸）、過硫酸銨+硫酸鋅、鹽酸+雙氧水+過硫酸銨、硝酸+雙氧水、硝酸+高氯酸、高氯酸+氯酸鈉等。通過對各種試劑的濃度及用量、消化溫度及時(shí)間的調(diào)整，以消化得到清亮無色溶液為消化終點(diǎn)，對整個(gè)消化過程進(jìn)行摸索。采用高氯酸0.5 ml、氯酸鈉溶液0.6 ml于130℃對血清進(jìn)行消化2 h，得到的消化效果最好[11]。

3.2 檢測方法及反應(yīng)體系

目前應(yīng)用較多的血清碘檢測方法主要是分光光度法和電感耦合等離子體質(zhì)譜法（ICP-MS）[12]，ICP-MS所需實(shí)驗(yàn)儀器昂貴，實(shí)驗(yàn)操作及數(shù)據(jù)分析需相關(guān)專業(yè)技術(shù)人員進(jìn)行，難于在基層推廣應(yīng)用，且血清用量較大。本標(biāo)準(zhǔn)選擇了砷鈰催化分光光度法，該方法簡便、儀器設(shè)備普通，而且與尿碘測定標(biāo)準(zhǔn)方法一致。

亞砷酸、硫酸鈰銨溶液濃度及用量直接影響測定吸光度值大小，以及對實(shí)驗(yàn)人員危害和環(huán)境污染的大小。因此對亞砷酸、硫酸鈰銨溶液濃度及用量的要求是既要減少三氧化二砷的用量，又要得出較好的測定結(jié)果。亞砷酸溶液和硫酸鈰銨濃度的選擇參考了《WS/T 107.1?2016 尿中碘的測定 第1部分：砷鈰催化分光光度法》[13]；通過實(shí)驗(yàn)確定了亞砷酸、硫酸鈰銨溶液用量，亞砷酸溶液（0.025 mol/L）3.0 ml， 硫酸鈰銨溶液（0.025 mol/L）0.6 ml，待標(biāo)準(zhǔn)系列中 300 μg/L碘濃度管吸光度值達(dá)到0.10左右時(shí)，在400 nm波長處測定[11]。

3.3 方法特性

3.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性 由6個(gè)研制單位實(shí)驗(yàn)室采用不同反應(yīng)溫度測定，得到本方法標(biāo)準(zhǔn)曲線線性r值，各實(shí)驗(yàn)室測定得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性相關(guān)系數(shù)為0.9 991～1.0 000；反應(yīng)條件：24.4℃，29 min，A值見表1，回歸方程為：C =47.78-259.60 lgA ，r=-0.9999。

表1 血清碘標(biāo)準(zhǔn)曲線A值測試結(jié)果

表2 方法精密度測定結(jié)果匯總表

表3 方法加碘標(biāo)回收測定結(jié)果匯總表

3.3.2 檢出限 對空白管（標(biāo)準(zhǔn)曲線0管）做10或12個(gè)平行樣測定，并同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線測定。按方法檢出限由空白值的3倍標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)算，于標(biāo)準(zhǔn)曲線上求出對應(yīng)碘濃度，5個(gè)實(shí)驗(yàn)室檢測限結(jié)果為：1.8～6.9 μg/L。本法檢出限為6.9 μg/L（取血清樣量為0.10 ml），可直接取樣消化測定0～300 μg/L濃度范圍血清碘。

3.3.3 精密度 在血清碘0～300μg/L范圍，各實(shí)驗(yàn)室各自對低、中、高不同碘濃度血清樣品采用本方法每次測定各3個(gè)平行樣求平均值，重復(fù)測定6次，5個(gè)實(shí)驗(yàn)室共對15個(gè)不同血清樣（碘濃度范圍：48.8～273.2 μg/L）測定的精密度結(jié)果：相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.7% ～3.8%，平均為1.7%。見表2。

3.3.4 準(zhǔn)確度 在血清碘0～300μg/L范圍，各實(shí)驗(yàn)室各自對低、中、高不同碘濃度血清樣（即為各自取3個(gè)血清樣）采用本方法進(jìn)行加碘標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，本底和加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)均為3個(gè)平行樣測定求平均值。5個(gè)實(shí)驗(yàn)室共對15個(gè)不同血清樣（碘濃度范圍：26.3～253.3μg/L）做加標(biāo)回收，加入碘標(biāo)準(zhǔn)50～100 μg/L，碘的回收率為96.2%～105.2%，平均為99.8%。見表3。

3.3.5 與ICP-MS方法對比血清碘測定結(jié)果 取血清樣品3個(gè)，每個(gè)樣品用不同方法各測定3次，加標(biāo)（50 μg/L）后各測定3次，兩種測定方法中血清碘測定的回收率在96.4%和107.8%之間，符合測定需求。同時(shí)，用尿碘標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對兩種方法加以驗(yàn)證，測定值均在給定值范圍內(nèi)，測試結(jié)果較為理想。

3.3.6 干擾實(shí)驗(yàn) 分別在100μg/L、200μg/L碘標(biāo)準(zhǔn)液中加入干擾物，各3個(gè)平行樣測定求平均值。3個(gè)制標(biāo)實(shí)驗(yàn)室測試結(jié)果均顯示，在本方法條件下，11 g/L NaCl，1.5 g/L HPO42-，700 mg/L KNO3，200 mg/L Ca2+、365 mg/L Mg2+，2 mg/L F-，2 mg/L Fe2+，2 mg/L Zn2+、2 mg/L Cu2+、0.05 mg/L Hg2+，2 g/L甘氨酸，10 g/L葡萄糖，3 g/L尿素，30 mg/L維生素C，100 g/L蛋白質(zhì)時(shí)，均不干擾測定，表明方法有較強(qiáng)的抗干擾能力。

3.3.7 樣品穩(wěn)定性 取幾份新鮮血液樣品分離血清樣品，制備成一個(gè)均勻的混合樣品，待測濃度為測定范圍的中等濃度。保存溫度分3個(gè)不同溫度：室溫（20℃）、冷藏（4℃）、低溫（-20℃）。計(jì)算下降率，|下降率|≤10%的天數(shù)為穩(wěn)定時(shí)間，結(jié)果表明，血清（n=3）中碘在室溫、冷藏、低溫條件下穩(wěn)定性良好，但室溫條件下血清顏色發(fā)生改變并逐漸出現(xiàn)絮狀物，建議在室溫下保存7天，在4℃下保存2個(gè)月，密封后冷凍至少可保存3個(gè)月。

3.4 不同消毒皮膚方法對血清碘結(jié)果的影響

在采集血液時(shí)，較為常見的消毒皮膚方法為酒精消毒和碘伏消毒。為了比較兩種不同消毒皮膚方法對血清碘測定結(jié)果的影響，對6名志愿者同時(shí)用兩種消毒方法進(jìn)行皮膚消毒后采樣（左臂采用酒精消毒，右臂采用碘伏消毒），然后進(jìn)行測定，用不同消毒皮膚方法采集的樣品測定結(jié)果未發(fā)現(xiàn)顯著差異。因此，在采集血液時(shí)，用兩種消毒皮膚方法均可。

3.5 方法的初步應(yīng)用結(jié)果

實(shí)驗(yàn)室1應(yīng)用本方法測定正常成人血清樣結(jié)果：得到185份正常成人血清碘含量平均水平為（66.32±15.46）μg/L，參考值范圍為36.02～96.62 μg/L。實(shí)驗(yàn)室2應(yīng)用本方法測定正常成人血清樣結(jié)果：得到18份不同正常人血清樣的碘含量范圍為43.3～75.2 μg/L，中位數(shù)為58.1 μg/L。制定方法設(shè)置碘標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍0～300μg/L，應(yīng)可滿足正常血清及高碘血清的碘含量測定需求。